MicroRNA-214對(duì)大鼠心肌梗死后心肌纖維化的影響.pdf

1、目的:心血管疾病是導(dǎo)致中老年死亡的常見(jiàn)原因之一，而心力衰竭是心血管疾病導(dǎo)致死亡的主要原因。在最近幾年有關(guān)microRNA-214(miR-214)的研究中，顯示出了其在心血管中的重要作用。大量的研究已經(jīng)展現(xiàn)出在急性心肌梗死中miR-214表達(dá)的相對(duì)水平是有區(qū)別的。
　　我們已經(jīng)研究了miR-214在大鼠的急性心肌梗死模型中通過(guò)磷酸酶-張力蛋白同源物途徑發(fā)揮調(diào)控左室重塑的作用。此次試驗(yàn)，我們將繼續(xù)深入的研究miR-214在大鼠模型中

2、急性心肌梗死后心臟纖維化的具體作用:通過(guò)結(jié)扎大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈的前降支制作急性心肌梗死的模型，心腔注射miR-214的前體及抑制劑來(lái)調(diào)節(jié)miR-214的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證表達(dá)情況，觀測(cè)不同的miR-214表達(dá)水平下膠原相關(guān)指標(biāo)的變化情況。
　　方法:
　　一心肌梗死大鼠模型的制備及miR-214的調(diào)節(jié)
　　成年大鼠麻醉后，氣管插管接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，被皮后逐層開(kāi)胸，暴露心臟于胸腔外，阻斷心臟血流約6秒，向心腔

3、內(nèi)緩慢注射藥物后，然后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。通過(guò)下腔靜脈注射依文思藍(lán)的方法證實(shí)結(jié)扎成功:梗死區(qū)的心肌組織是蒼白色的，非梗死區(qū)的心肌則被染成藍(lán)色。將80只大鼠隨機(jī)分成4組:假手術(shù)組（穿過(guò)線后未做結(jié)扎n=20），對(duì)照組（結(jié)扎前心腔內(nèi)注射PBS，n=20），miR-214上調(diào)組（結(jié)扎并心腔內(nèi)注射miR-214前體，n=20），miR-214下調(diào)組(結(jié)扎并心腔內(nèi)注射miR-214抑制劑，n=20)。于手術(shù)后2周和6周取材，觀察比較這兩個(gè)時(shí)間段各

4、指標(biāo)的不同變化。二心重體重比和組織學(xué)分析
　　大鼠稱重后通過(guò)腹腔內(nèi)注射水合氯醛的方法處死，取下心臟，稱重后放入10％福爾馬林中固定。固定好的樣本石蠟包埋，切成5um的厚度放于載玻片上進(jìn)行馬松染色。
　　三 PCR和western
　　取1mm*1mm的梗死邊緣區(qū)的小塊組織，放入EP管中，檢測(cè)miR-214及mmp1的mRNA的表達(dá)及膠原Ⅰ，膠原Ⅲ，mmp1和tgf-β1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　一心重體

5、重比
　　稱量每只大鼠的體重(g)和心臟重量(mg)在取材時(shí)，計(jì)算得出的在2周和6周各組的心重體重比:對(duì)照組和前體組，抑制劑組和前體組具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且前一組明顯高于后面的一組。這一結(jié)果間接表明心肌組織中miR-214的表達(dá)上調(diào)能夠抑制急性心肌梗死后的心肌纖維化。與此同時(shí)，如果miR-214的表達(dá)下調(diào)則有利于心肌纖維化的發(fā)生。
　　二馬松染色
　　選取心肌梗死后6周的大鼠左心室心肌進(jìn)行馬松染色。結(jié)果顯示:對(duì)照組與

6、前體組對(duì)比有更多的纖維組織增生，而抑制劑組的膠原增生最明顯。
　　三實(shí)時(shí)定量PCR
　　通過(guò)RT-PCR驗(yàn)證不同組別之間miR-214的表達(dá)水平。在不同的時(shí)間段，與前體組相比，對(duì)照組miR-214的表達(dá)明顯增加。相對(duì)于對(duì)照組和前體組，抑制劑組表達(dá)的miR-214最少。并且各組之間具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著miR-214表達(dá)水平的變化，mmp1呈現(xiàn)一個(gè)相反的趨勢(shì)。對(duì)照組與前體組的表達(dá)具有明顯差異，而抑制劑組mmp-1的表達(dá)顯著

7、高于前體組。
　　四 western
　　Western的結(jié)果顯示除了不同的分組中各項(xiàng)指標(biāo)的不同表達(dá)。在miR-214表達(dá)水平高的分組（前體組），膠原Ⅰ，膠原Ⅲ，mmp1和tgf-β1的蛋白表達(dá)是降低的。在2周和6周時(shí)，假手術(shù)組、對(duì)照組、抑制劑組的表達(dá)與前體組相比具有顯著差異。在2周時(shí)，膠原Ⅰ/Ⅲ在各組間沒(méi)有明顯差異，而6周時(shí)差異明顯?？偟膩?lái)說(shuō)，在miR-214的表達(dá)上調(diào)組，促進(jìn)纖維化的各項(xiàng)指標(biāo)均高于單純結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支