一抗、二抗的選擇

1、一抗、二抗的選擇,,一抗的選擇,1.分析實驗應用類型WB（Western Blot 免疫印跡 ）IHC （immunohistochemistry免疫組織化學）ELISA（enzyme-linked immunoadsordent assay 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ）,2.樣本蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)樣本蛋白的結(jié)構(gòu)域 全長蛋白、蛋白片段、多肽、 細菌、細胞 樣本的提取和處理過程某些抗體要求樣本經(jīng)過

2、某些特殊處理，例如：許多抗體只識別還原和變性的、表位已暴露不受二級四級結(jié)構(gòu)阻礙的蛋白樣本，某些抗體僅識別天然折疊狀態(tài)的蛋白。當選擇免疫組化的抗體時，應注意某些抗體只識別未固定的冷凍的組織，另一些抗體則適用于無需抗原修復解交聯(lián)步聚的甲醛固定石蠟包埋的組織，,蛋白片斷或一種特殊的同型物或蛋白全長的某一區(qū)域,,用含此片段域的免疫原制備出的抗體。,用FACS流式檢測活細胞的表面蛋白,,用含該表面蛋白的胞外域來免疫制備的抗體。,,3.樣本的物

3、種 選擇物種相同或有交叉反應的抗體，抗體可能與不同物種的同種靶蛋白有交叉反應，因其氨基酸序列同源性較高，如果樣本的種類未列入抗體說明書上的交叉反應種屬表中，并不意味著該抗體不適用于檢測該物種的蛋白，而只是表示該物種尚未用此抗體檢測驗證過，應通過序列比對的方法來預測交叉反應，可應用Expasy 和 NCBI BLAST來進行不同物種蛋白同源性比對。,4.一抗宿主物種的選擇一般說來，在使用偶聯(lián)二抗結(jié)合無

4、偶聯(lián)物的一抗時，一抗宿主動物的物種選擇較為重要，對于免疫組化而言，盡可能選擇與樣本不同種系物種的一抗，從而避免二抗與樣本內(nèi)源性免疫球蛋白產(chǎn)生交叉反應，例如：檢測小鼠樣本蛋白，則不應選擇小鼠或大鼠源的一抗，最好選兔源的一抗，則二抗則可選擇偶聯(lián)了檢測分子（酶、熒光素、生物素等）的抗兔IgG。如果選擇有偶聯(lián)物的一抗則不適用上述情況，除免疫組化外的其它對不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣本的檢測方法，則抗體宿主物種的影響不大，如對不含IgG的細胞裂解物

5、樣本的western blotting檢測，盡管如此，含有血清的組織裂解物和組織培養(yǎng)上清中含有免疫球蛋白，還原變性樣本中含IgG，在western blot檢測中則結(jié)合出現(xiàn)IgG分子50 and 25 kDa的重鏈和輕鏈條帶。,二抗的選擇,1.一抗的種屬來源 二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，,2.二抗的種屬來源 一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山

6、羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。在一些特殊的實驗里，如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。,3二抗的偶聯(lián)標記 主要有酶（辣根過氧化酶HRP和堿性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆

7、粒。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗；細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標記；金顆粒標記的二抗則更多的應用于免疫電鏡中。,4

8、.是否經(jīng)過血清吸附過的二抗為減少二抗與樣本的非特異性結(jié)合，可選擇經(jīng)過血清吸附過的二抗如檢測樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果對實驗的特異性要求很高，選擇經(jīng)過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由于經(jīng)過人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發(fā)生非特異性反應的IgG，因此將非特異性結(jié)合降低到最低。,5.二抗的類別亞型IgM是體液免疫應答首先產(chǎn)生的Ig。IgA是機體黏膜防御感染的重

9、要因素。IgG是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgGIgE是同速發(fā)型過敏反應發(fā)生有關的Ig。IgD以膜結(jié)合形式存在于B細胞，在B細胞分化發(fā)育中起重調(diào)節(jié)有作用,,IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗

10、體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。,免疫球蛋白在不同疾病的濃度高低  IgG 正常情況下，臍血IgG含量為7.6～17g/L；血IgG含量新生兒為7.0～14.8 g/L，0.5～6個月為3～10.0 g/L，6個月～2歲為5～12 g/L，2～6歲為5～13g/L，6～12歲為7～16.5g/L，12～16歲為7～15.5g/L

11、，成人為6～16g/L。IgG增高：患慢性肝病、亞急性或慢性感染、結(jié)締組織疾病、IgG骨髓瘤、無癥狀性單克隆IgG病等；IgG降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合征、選擇性IgG缺乏癥、蛋白丟失性腸病、腎病綜合癥、強直性肌營養(yǎng)不良、免疫抑制劑治療等情況下。  IgA 正常情況，臍血IgA含量為0～50mg/L; 血內(nèi)IgA含量新生兒為0～22mg/L，0.5～6個月為3～820mg/L，7個月～2歲

12、為140～1080 mg/L，2～6歲為230～1900mg/L，6～12歲為290～2700mg/L，12～16歲為810～2320mg/L，成人為760～3900mg/L。IgA增高：在慢性肝病，亞急性或慢性感染性疾?。ㄈ缃Y(jié)核、真菌感染等）、自身免疫性疾?。ㄈ鏢LE、類風濕關節(jié)炎）、囊性纖維化、家族性嗜中性粒細胞減少癥、乳腺癌、IgA腎病、IgA骨髓瘤等情況下；IgA降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、免疫缺陷病、選擇性IgA缺乏

13、癥、無γ－球蛋白血癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗IgA抗體綜合癥、免疫抑制劑治療、妊娠后期等情況下。    IgM 正常情況下，臍血IgM含量為40～240mg/L，血內(nèi)IgM含量新生兒為50～300mg/L，0.5～6個月為150～1090mg/L，6個月～2歲為430～2390mg/L，2～6歲為500～1990mg/L， 6～12歲為500～2600mg/L，12～16歲為450～2400mg/L，成人為4

14、00～3450mg/L。IgM增高：在胎兒宮內(nèi)感染、新生兒TORC H綜合癥、慢性或亞急性感染、瘧疾、傳染性單核細胞增多癥、支原體肺炎、肝病、結(jié)締組織疾病、巨球蛋白血癥，無癥狀性單克隆IgM病等情況下，；IgM降低：在遺傳性或獲得性抗體缺乏癥、混合性免疫缺陷綜合癥、選擇性IgM缺乏癥、蛋白丟失性腸病、燒傷、抗Ig抗體綜合癥（混合性冷球蛋白血癥）、免疫抑制等情況下，。,IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10

15、個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約為900000，IgG分子量約為150000。機體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM抗體一般為保護性抗體具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值。 IgM 是抗原刺激誘導體液免疫應答中最先產(chǎn)生的Ig ，Ig

16、M 不是細胞，但可結(jié)合補體，主要分布于血清中。由于IgM 有較高的結(jié)合價，所以是高效能的抗生物抗體，其殺菌、溶菌、促吞噬和凝集作用比IgG 高500- 1000 倍，IgM 在機體的早期防御中起著重要的作用。,IgM,IgA 分血清型和分泌型兩種，血清型多為單體，也有二聚體，血清型IgA可介導調(diào)理吞噬ADCC 作用；分泌型的都是二聚體，且含有分泌片。分泌型IgA（SIgA）是機體粘膜防御系統(tǒng)的主要成分，覆蓋在鼻、咽、氣管、腸和膀胱

17、粘膜的表面，它能抑制微生物在呼吸道上皮附著，減緩病毒繁殖，是粘膜重要屏障，對某些病毒、細菌和—般抗原具有抗體活性，是防止病原體入侵機體的第一道防線。外來抗原進入呼吸道或消化道，局部免疫系統(tǒng)受到刺激后，無需中央免疫系統(tǒng)的參與，自身就可進行免疫應答，產(chǎn)生分泌型抗體，即SIgA。已有研究證明，呼吸道分泌液中SigA 含量的高低直接影響呼吸道粘膜對病原體的抵抗力，兩者呈正相關。初乳中含有分泌型的sIgA　。IgA的凝聚物可以通過經(jīng)典途徑

18、激活補體。,IgA,人體血清免疫球蛋白IgG是初級免疫應答中最持久、最重要的抗體，它僅以單體形式存在。大多抗菌性、抗毒性和抗病毒抗體屬于IgG，它在抗感染中起到主力軍作用，它能夠促進單核巨噬細胞的吞噬作用（調(diào)理作用），中和細菌毒素的毒性（中和毒素）和病毒抗原結(jié)合使病毒失去感染宿主細胞的能力（中和病毒）。IgG 在機體合成的年齡要晚于IgM，在出生后第3 個月開始合成，3-5 歲接近成年人水平。它是唯一能通過胎盤的Ig，在自然被動免

19、疫中起重要作用。此外，IgG 還具有調(diào)理吞噬和結(jié)合SPA等作用。,IgG,【Anti-IgG還是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B細胞等細胞內(nèi)，通常含有較多的Fc受體，這時候選擇二抗時最好選擇Anti-IgG, F（ab’）2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由于Fc部分與IgG的非特異性結(jié)合。常規(guī)的Anti-IgG （H+L）二抗與IgG的重

20、鏈和輕鏈都有結(jié)合反應，即與IgG的Fc的F（ab’）2片段都能結(jié)合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此Anti-IgG （H+L）與它們都有交叉反應。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment經(jīng)過了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F（ab’）2片段結(jié)合。,針對某一種屬的抗體可能會和其他一些種屬有交叉反應。牛血清白蛋白和奶粉可能含有與抗牛IgG、抗山羊IgG、抗馬IgG、抗綿羊IgG等抗體反應的Ig