hiv感染的血清學(xué)檢測

1、1,,,HIV感染的血清學(xué)檢測,,2,內(nèi)容,HIV抗體檢測：HIV抗體篩查檢測HIV確認(rèn)實(shí)驗(yàn)HIV P24抗原檢測：,3,HIV抗體檢測,,全國艾滋病檢測技術(shù)規(guī)范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2004年版）,,4,HIV抗體檢測可用于監(jiān)測、診斷、血液篩查：以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢而進(jìn)行的檢測，檢測的人群包括各類高危人群和一般人群。

2、以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況而進(jìn)行的檢測，包括臨床檢測和自愿咨詢檢測、術(shù)前檢測、根據(jù)特殊需要進(jìn)行的體檢等。以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV而進(jìn)行的檢測，包括獻(xiàn)血員篩查和原料血漿篩查。HIV抗體檢測分為篩查試驗(yàn)（包括初篩和復(fù)檢）和確認(rèn)試驗(yàn),5,HIV抗體試劑盒進(jìn)展,代次 抗原 方法特異性檢測 檢測時間1 全病毒

3、 間接 IgG 抗體HIV-1 > 2個月2 重組或多肽 間接 IgG 抗體HIV-1 / -2 3-4 周3 重組+多肽 夾心 IgM / IgG 抗體 4-7 天 HIV-1 / -

4、2 / -O4 抗原+抗體 夾心IgM / IgG 抗體 抗原 5pg HIV-1 / -2 / -O p24 抗原,,6,HIV抗體檢測篩查試驗(yàn),,7,HIV抗體篩查檢測,程序

5、篩查、復(fù)檢、確認(rèn)原理酶聯(lián)免疫、凝集、層析標(biāo)本血液、唾液、尿液、組織液產(chǎn)品ELISA、快速、簡單,8,篩查試劑要求,HIV ½混合型國家SDA生物診斷試劑注冊批準(zhǔn)批檢合格臨床評估質(zhì)量優(yōu)良,9,篩查方法：常用的篩查方法是酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）快速檢測（RT）及其它檢測 (1)明膠顆粒凝集試驗(yàn)(PA) (2)斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA (dot-EIA) (3)斑點(diǎn)免疫膠體金（或膠

6、體硒）快速試驗(yàn) (4)艾滋病唾液檢測卡尿液HIV抗體檢測,10,一、酶聯(lián)免疫試驗(yàn)：ELISA,,11,包被抗原,血中抗體與抗原反應(yīng),顯色反應(yīng),酶聯(lián)免疫法,病毒溶解抗原、重組的衍生抗原、合成肽抗原,酶聯(lián)HRP、AP或化學(xué)發(fā)光,12,（一）斑點(diǎn)EIA或稱斑點(diǎn)ELISA（dot-EIA）以硝酸纖維膜為載體，將HIV抗原滴在膜上成點(diǎn)狀，即為固相抗原。加血清樣品作用，以后步驟同ELISA。陽性結(jié)果在膜上抗原部位顯示出有色斑點(diǎn)。反應(yīng)時間

7、在10 min以內(nèi)，使用抗原量少。,二、快速診斷試劑,13,（二）免疫膠體金（或膠體硒）快速試驗(yàn)與斑點(diǎn)EIA相似，也是以硝酸纖維膜為載體。區(qū)別在于不用酶標(biāo)記抗體，而代之以紅色的膠體金（或膠體硒）A蛋白，用滲濾法作為洗滌方法。,,14,穩(wěn)定，可室溫長期保存。試驗(yàn)不需任何設(shè)備，迅速、簡便、特異性較好，敏感性約相當(dāng)于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個體檢測。已有被SFDA批準(zhǔn)注冊的進(jìn)口試劑和國內(nèi)產(chǎn)品。一般可在10?30mi

8、n內(nèi)判讀結(jié)果。,免疫膠體硒快速試驗(yàn)特點(diǎn),15,樣品墊: 加入血漿,血清或全血樣品.紅細(xì)胞在此遷移過程中被去除,質(zhì)控條:固定的含捕捉硒標(biāo)物的特異性試劑,不管樣品中有無被檢測物都應(yīng)出現(xiàn)紅色線條.控制測試結(jié)果的有效性,病人條:固定的含特異性分析試劑,任何與硒標(biāo)特異性試劑結(jié)合的分析復(fù)合物在此被結(jié)合固定,形成三文治結(jié)合物,肉眼可見的紅色線條說明有陽性反應(yīng),連接物墊:含分析特異性試劑結(jié)合的硒標(biāo),為一種肉眼可見的紅色信號,被分析物和硒標(biāo)特異性試劑在此

9、反應(yīng)結(jié)合,16,撕下所需的測試紙條數(shù),撕下表面保護(hù)膜,17,血清/血漿樣品加50ul樣品于樣品墊中,15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果,18,全血樣品 加50ul樣品于樣品墊中,手指血方法,靜脈血方法,加一滴緩沖液,15分鐘內(nèi)讀取結(jié)果,19,病人條,質(zhì)控條,,,20,注意事項(xiàng),非EDTA抗凝的血漿樣品可能會 得到不正確的結(jié)果反應(yīng)條顏色深淺的程度與樣品中 抗體的滴度沒有必然的聯(lián)系 結(jié)果的判斷……,21,（三）艾滋病唾液檢測卡在

10、硝酸纖維膜上包被人工合成的HIVgp41/gp36蛋白抗原，可同時檢測含在唾液中的HIV-1/HIV-2抗體，原理為酶免疫間接法。主要檢測唾液中的HIV IgA與IgG抗體，敏感性特異性與ELISA相近，可避免靜脈穿刺。但樣品預(yù)處理時間長且售價較高。以唾液為樣品測定HIV抗體的ELISA、免疫印跡法（WB）試劑已經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)。,22,（四）明膠顆粒凝集試驗(yàn)（PA）PA是HIV血清抗體檢測的一種簡便方法，是將HIV抗原致敏明膠顆

11、粒作為載體，與待檢樣品作用，混勻后保溫（一般為室溫）。當(dāng)待檢樣品含有HIV抗體時，經(jīng)抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結(jié)果。PA試劑有兩種，HIV-1和HIV-2抗原共同致敏的PA試劑（AFD HIV-1/2 PA），已經(jīng)我國食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）注冊批準(zhǔn)；HIV-1、HIV-2抗原分別致敏的PA試劑（SERODIA-HIV-1/2）可初步區(qū)分HIV-1型和HIV-2型，目前我國尚未引

12、進(jìn)。,,23,尿液測定,采樣優(yōu)點(diǎn)，尤其對吸毒者標(biāo)本機(jī)理：IgA為主，IgG少量HIV-1型抗體陽性結(jié)果務(wù)必用血清學(xué)檢測,24,快速試劑的應(yīng)用,偏遠(yuǎn)地區(qū)急診臨床（高危）職業(yè)暴露臨產(chǎn),25,結(jié)果報告： 對呈陰性反應(yīng)的樣品，可由實(shí)施檢測的實(shí)驗(yàn)室出具HIV抗體陰性報告。 對呈陽性反應(yīng)的樣品，須進(jìn)行復(fù)檢，不能出陽性報告。復(fù)檢試驗(yàn)： 對初篩呈陽性反應(yīng)的樣品用原有試劑和另外一種不同原理

13、或不同廠家的篩查試劑重復(fù)檢測。 如果兩種試劑復(fù)測均呈陰性反應(yīng)，則報告HIV抗體陰性；如均呈陽性反應(yīng)，或一陰一陽，需送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。 對初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報告。,26,初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)樣品的轉(zhuǎn)送： 填寫“HIV抗體待復(fù)測送檢單”，經(jīng)1名檢驗(yàn)人員和1名具有中級以上技術(shù)職稱的人員審核簽字。送當(dāng)?shù)匕滩『Y查中心實(shí)驗(yàn)室，再轉(zhuǎn)送艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室，或在本

14、實(shí)驗(yàn)室復(fù)檢后直接送確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室。 對篩查陰性和陽性者，均需做好檢測后咨詢。,27,HIV抗體初篩檢測流程圖,28,初篩試驗(yàn)結(jié)果的報告,對HIV抗體篩查試驗(yàn)：“—” “HIV抗體陰性”報告（可用附表“+” 不能出陽性報告，可出具“HIV抗體待復(fù)查”報告,,,29,對HIV抗體篩查試驗(yàn)，呈陰性反應(yīng)者可出具“HIV抗體陰性”報告,30,,對初篩試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)者不能出陽性報告，可出具

15、“HIV抗體待復(fù)查”報告,31,32,HIV抗體檢測確認(rèn)試驗(yàn),33,HIV抗體確認(rèn)試驗(yàn),確認(rèn)試驗(yàn)的試劑： 必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準(zhǔn)、在有效期內(nèi)的試劑。確認(rèn)試驗(yàn)方法： 包括免疫印跡試驗(yàn)(WB)、條帶免疫試驗(yàn)(LIATEK HIVⅢ)、放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)及免疫熒光試驗(yàn)(IFA)。國內(nèi)常用的確認(rèn)試驗(yàn)方法是WB。,34,蛋白印跡實(shí)驗(yàn)（WB）——廣泛使用的確認(rèn)實(shí)驗(yàn)基本原理HIV全

16、病毒抗原經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳,將分子量大小不等的HIV抗原蛋白帶分離開來,然后再把這些已經(jīng)分離的不同蛋白帶電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將此膜切割成條狀,每一條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)電泳分離過的HIV病毒抗原。,35,將待檢血清樣品加到硝酸纖維素膜上,恒溫震蕩,使其充分接觸反應(yīng),血清中若含有抗HIV抗體,就會與膜條上的抗原帶相結(jié)合。加入酶偶聯(lián)的抗人IgG抗體和底物，即可使有反應(yīng)的抗原-抗體結(jié)合帶呈現(xiàn)紫褐色,根據(jù)出現(xiàn)條帶情況判定結(jié)果。,36

17、,蛋白質(zhì)抗原分子經(jīng)電泳分開,血液中的抗體與抗原反應(yīng)，形成不同的條帶,Western Blot,37,方法,38,其可檢測標(biāo)本中針對HIV不同抗原的抗體，故被用做確認(rèn)試劑。不同的研究機(jī)構(gòu)有不同的判定標(biāo)準(zhǔn),39,WB結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),“不確定”(±)：出現(xiàn)HIV-1特異性條帶，但帶型不足以 確認(rèn)陽性，每三個月隨訪一次，共兩次， 仍屬可疑，判為陰性,,,,,,,,40,HIV抗體確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,41,不確定標(biāo)本的

18、處理,原因特異性和非特異性因素標(biāo)本種類，操作技術(shù)，感染時 間，指征把握等處理隨訪（注意一根條帶）保存,42,試驗(yàn)中應(yīng)注意的問題,嚴(yán)格按照說明書操作和閱讀判斷結(jié)果典型帶型和顏色；強(qiáng)調(diào)env帶非典型全而淡、一根主要條帶、高危人群、不確定，等等特異性高，但也有漏檢核對、多種、操作技術(shù),43,,,,免疫印跡法（WB，HIV-1/2混合型）,,,HIV-1陽性反應(yīng),不確定反應(yīng),,出現(xiàn)HI

19、V-2指示條帶,報告HIV-1陽性,不確定反應(yīng),陽性反應(yīng),陰性反應(yīng),報告陰性,,,,每3個月隨訪1次，共2次，仍屬可疑，則報告陰性；如隨訪期間HIV抗體出現(xiàn)陽性反應(yīng)則報告陽性。隨訪期間可根據(jù)需要，檢測病毒核酸和或P24抗原，作為輔助診斷。,,,,,,,,,,,,,陰性反應(yīng),報告陰性,篩查試驗(yàn)陽性反應(yīng)樣品,報告HIV-2血清學(xué)陽性,免疫印跡法（WB，HIV-2）,,圖2 HIV抗體確認(rèn)檢測流程,44,P24抗原檢測,,45,窗口期,,第

20、一/二代試劑檢測IgG抗體，第三代試劑檢測IgG 、IgM抗體,第四代試劑同時檢測IgG、 IgM抗體和P24抗原使窗口期縮短。,46,窗口期,窗口期的決定因素初篩試劑質(zhì)量和測試技術(shù)機(jī)體免疫反應(yīng)病毒特性窗口期無法避免,47,P24抗原測定適用范圍,HIV-1抗體不確定或窗口期的輔助診斷。HIV-1陽性母親所生嬰兒的鑒別診斷。第四代HIV-1抗原/抗體ELISA試劑檢測呈陽性反應(yīng)， 但HIV-1抗體確認(rèn)陰性者的診斷。監(jiān)

21、測病程進(jìn)展和抗病毒治療效果。,48,檢測原理,P24抗原的檢測通常是采用ELISA夾心法，已知抗體包被固相反應(yīng)板孔底，加入待測血清，若血清中含有P24抗原則與包被抗體形成抗原-抗體復(fù)合物，再加入酶（HRP）標(biāo)記的HIV-1抗體與抗原結(jié)合，加底物顯色，在酶標(biāo)儀上讀結(jié)果。,49,為了提高檢測血清中P24抗原的敏感性，需先將血清中免疫復(fù)合物解離后再進(jìn)行測定目前已發(fā)展了ICD P24抗原（immun-complex disassociate，

22、免疫復(fù)合物解離，ICD）測定試劑，用于HIV-1 P24抗原測定。即使將復(fù)合物解離，敏感性提高，也只能在大約50%無癥狀感染者中檢出P24抗原。,50,結(jié)果報告和解釋,定性分析：1、 HIV-1 P24抗原的陽性結(jié)果必須經(jīng)過中和試驗(yàn)確認(rèn)。2、 HIV-1 P24抗原陽性僅作為HIV感染的輔助診斷依據(jù)，不能依此確診。3、HIV-1 P24抗原陰性結(jié)果只表示在本試驗(yàn)中無反應(yīng)，不能排除HIV感染。4、嬰幼兒經(jīng)過胎盤或哺乳從母親獲得的H

23、IV抗體不能用于診斷是否經(jīng)母嬰傳播感染HIV。嬰幼兒體內(nèi)從母親得到的HIV抗體持續(xù)存在時間最長不超過18個月。在18月齡以前可以用多種不同的非抗體依賴性的檢驗(yàn)方法對新生兒HIV感染進(jìn)行輔助診斷，包括：HIV P24抗原檢測、病毒分離培養(yǎng)、RNA或DNA測定。,51,結(jié)果報告和解釋,定量分析： 1、試劑盒給定的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋 （平行孔）2、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和檢測結(jié)果(吸光度值)繪出定量曲線，然后按照各標(biāo)本的檢測結(jié)果(吸光度值) 計(jì)