第九章 血清學反應

1、第九章 血清學反應,,4/1/2024,2,一 血清學反應的概念及一般特點 抗原及相應抗體在體內(nèi)或體外均能發(fā)生特異性結(jié)合，在體外結(jié)合能發(fā)生可見免疫反應。由于抗體主要存在于血清中，故稱為血清學反應。 血清學反應根據(jù)抗原性質(zhì)、反應條件、參與反應物質(zhì)，則表現(xiàn)出反應有多種多樣。其反應的一般特點是：,第一節(jié) 概 述,4/1/2024,3,（一）特異性和交叉性 血清學反應具有高度特異性?？乖荒芘c相應抗體結(jié)合，而不能

2、與其他抗體相結(jié)合。 生物體的組成是復雜的，包含有多種抗原成分，在進化過程中形成不同的種類，有各不相同的特異性抗原，在親緣種系中往往含有部分相同的抗原成分，能引起交叉反應。,4/1/2024,4,（二）結(jié)合的可逆性 抗原抗體結(jié)合是分子表面結(jié)合，這一結(jié)合受理化因素的影響，當溫度超過60?C或pH降至3以下時，則抗原抗體復合物又重新離群。離群后的抗原、抗體，其理化性質(zhì)、免疫活性保留。,4/1/2024,5,（三）最適比與帶現(xiàn)

3、象 抗原與抗體結(jié)合，其比例適當時才可出現(xiàn)可見反應。比例最適合，出現(xiàn)反應最快，反應產(chǎn)物愈多。 如果抗原或抗體過多，抗體和抗原結(jié)合點的聚合一開始時即達到飽和，形成小的復合物則不能繼續(xù)與相鄰抗原、抗體結(jié)合，不出現(xiàn)可見反應，謂之區(qū)帶現(xiàn)象或帶現(xiàn)象。為了避免血清學反應的帶現(xiàn)象，需要將抗原或抗體作適當?shù)南♂尅?4/1/2024,6,,4/1/2024,7,比例不適合—不能完成第二步反應 —帶現(xiàn)象,4/1/2024,8,（四）反應的階段

4、性 抗原與抗體進行結(jié)合，可分為兩個階段： 第一階段為抗原與抗體的特異性結(jié)合階段，反應快，幾秒鐘至幾分鐘即完成，但無可見反應； 第二階段為抗原與抗體的反應可見階段，表現(xiàn)為凝集、沉淀、補體結(jié)合等，反應進行較慢，需幾分鐘或更久。第二階段受電解質(zhì)、溫度、pH值等影響。兩個階段在反應進行中無嚴格界限。,4/1/2024,9,（五）影響反應的因素1.電解質(zhì) 血清學反應須在適當濃度的電解質(zhì)參與下，才出現(xiàn)可見反應。

5、在凝集、沉淀反應操作時，一般用生理鹽水或8%—10%高滲鹽水作稀釋，才出現(xiàn)較強反應。,4/1/2024,10,2.溫度 溫度升高，可增加抗原與抗體分子運動而碰撞接觸，加速反應的出現(xiàn)，故通常將抗原抗體混合后，放置37?C溫箱或水浴箱中，保持一定時間，促進反應。溫度高，加速反應；溫度低，反應時間延長，但反應結(jié)合充分，故在補體結(jié)合反應、免疫吸附實驗中，采用低溫放置過夜。,4/1/2024,11,3.酸堿度 血清學反應通

6、常用pH6～8，過酸或過堿都可使復合物離群，pH值在等電點時，可引起非特異凝集。,4/1/2024,12,二 血清學反應的類型 沉淀、凝集、瓊脂擴散、中和、補體結(jié)合和免疫吸附試驗等。,,4/1/2024,13,三 血清學反應的應用方式和目的 抗原抗體反應是特異性的，在應用時必須有一個是已知的，通過反應來鑒定另一個未知的。例如鑒定某一病原微生物時，多用已知抗體。診斷傳染病時，對慢性病可用已知的抗原檢測未知的特異性抗體；診斷急性

7、病則用已知的抗體檢測未知的抗原（病原），如炭疽病等。,4/1/2024,14,（一）抗原與抗體的快速檢測 在診斷傳染病、寄生蟲病、變態(tài)反應、腫瘤、自身免疫疾病時，均已廣泛應用血清學方法檢查抗體或抗原（細菌、病毒）的存在，作為診斷疾病的手段。現(xiàn)已應用的間接血凝技術、對流電泳、標記抗體技術，均能快速、簡便的確診抗原或抗體。,4/1/2024,15,（二）生物活性物質(zhì)的超微定量 應用酶聯(lián)免疫吸附實驗、放射免疫等技術，抗

8、原抗體檢測的敏感度均大為提高，已達到能精確測出Pg的水平，其敏感度已大大超過了常規(guī)的化學分析。此類技術已應用于測定動物體內(nèi)的激素、維生素、藥物及其他病理過程中的微量產(chǎn)物。,4/1/2024,16,（三）抗原或抗體在細胞與亞細胞水平的定位 用熒光抗體、酶標抗體技術，可以檢測病毒或細菌在動物各種組織細胞中的分布。應用免疫酶組化法及鐵蛋白標記技術進行免疫電鏡觀察，可以測定病毒在亞細胞水平的定位，也可測定淋巴細胞表面免疫球蛋白及抗體的

9、產(chǎn)生情況。據(jù)此可分析傳染病發(fā)生的機制及對免疫機理的探討。,4/1/2024,17,（四）微生物的鑒定與分析 應用交叉凝集實驗、凝集吸收實驗、沉淀實驗等血清學實驗，進行微生物的鑒定及區(qū)別微生物的血清型，從而確定微生物的類型及其親緣關系。還可應用瓊脂擴散實驗、免疫電泳等技術，對微生物的抗原組分進行分析。,4/1/2024,18,（五）血型鑒定 用細胞直接凝集實驗、血凝抑制實驗、溶血實驗等技術，可作血型鑒定、親子關系的

10、確定、新生兒和出生幼畜溶血病的診斷。,4/1/2024,19,第二節(jié) 沉淀試驗,可溶性抗原與相應抗體結(jié)合，在適量電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的絮狀白色沉淀，稱之為沉淀試驗（Precipitationreaction test）。 可溶性抗原 +免疫血清 出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象 (血清蛋白、病毒) （抗體） 比例適合 沉淀原

11、 沉淀素 比例不適合 不出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象,,0.85%NaCl,4/1/2024,20,一 液相沉淀試驗 1．環(huán)狀沉淀試驗 原理：試管內(nèi)，下層沉淀素與上層 沉淀原在液界面應形成白色沉淀環(huán)。 用途：檢測皮毛中的炭疽 桿菌抗原（Ascoli試驗） 2．絮狀沉淀試驗 抗原與抗體在試管內(nèi)混合，在電解質(zhì)的存在下抗原抗體復合物可形成絮狀凝聚物。此法多用于毒素和抗毒素測定。,4/1/2024,21,二

12、瓊脂擴散試驗,瓊脂是一種含有硫酸基的多糖，加熱溶解于水，冷卻后凝固成凝膠，瓊脂凝膠是一種多孔結(jié)構(gòu)，其孔徑大小與瓊脂含量有關，1%瓊脂凝膠孔徑為85nm，能使許多可溶性抗原與抗體在凝膠中擴散。當抗原與抗體在凝膠中的一定位置上相遇時，則兩者結(jié)合形成沉淀線。沉淀線的位置與抗原、抗體顆粒的大小、濃度，沉淀線的數(shù)目和所含抗原組分有關。瓊脂擴散可分為單擴散（抗原或抗體中一種成分擴散）和雙擴散。 根據(jù)其擴散的方向可分為單向單擴、單向雙擴、雙向

13、單擴、雙向雙擴，其中雙向雙擴應用最廣。,4/1/2024,22,1 ．單向單擴散,將0.6%-1%瓊脂加熱熔化后，加入定量經(jīng)預熱的稀釋抗血清，混合均勻后，加入小試管中，待凝固后加入0.5ml抗原于其上，直立，置于37?C中，2-3h后出現(xiàn)沉淀線。由于抗原的擴散，使沉淀線不斷向下推移，而最初形成的沉淀帶隨抗原的擴散而向下推移，最后穩(wěn)定。沉淀帶距抗原愈近，其濃度愈大，可作抗原濃度測定。,4/1/2024,23,2 ．單向雙擴散 基

14、本作法同上，但在抗原與抗體之間加一層不含抗體的鹽水瓊脂，抗原與抗體均向中間瓊脂擴散，形成沉淀帶。主要用于抗原成分的分析。,4/1/2024,24,3 ．雙向單擴散 亦稱輻射擴散。在平皿或玻板上進行。用2%緩沖瓊脂鹽水，加熱融化，待冷后加入經(jīng)預熱的抗血清（用1：5-10倍稀釋），混合后倒入平皿或玻板上，厚2-3mm。凝固后在凝膠板上打孔，孔徑2-3mm，孔內(nèi)滴加抗原液，放置濕盒中37?C下擴散。抗原在孔內(nèi)向四周擴散，與凝膠中的抗

15、體接觸，形成白色沉淀環(huán)，白環(huán)的大小隨抗原的濃度而增大。此法在獸醫(yī)臨床上用于蛋白質(zhì)定量實驗。,4/1/2024,25,4．雙向瓊脂擴散（瓊擴） 此法系采用1%瓊脂倒于平皿或玻片上，制成凝膠板，可按需要打孔。將抗原、抗體分別滴入孔內(nèi)，放置濕盒中，在37?C濕箱中24-72h后觀察。在抗原與抗體孔間形成沉淀帶。每一種抗原成分出現(xiàn)一條沉淀帶。,4/1/2024,26,結(jié)果判斷： 如兩個相鄰孔之間抗原相同，則沉淀帶融合；抗原則

16、不同，則互相交叉；部分相同則部分融合，另外不同部分則交叉。,4/1/2024,27,特點：簡便、敏感性低、耗時、應用最廣用途：常用于細菌、病毒的鑒定，抗血清效價的測定，抗原組分的分析及傳染病的診斷等，如馬傳染性貧血病的診斷。,4/1/2024,28,第三節(jié) 凝集試驗,細菌、紅細胞等顆粒狀態(tài)的抗原與相應的抗體結(jié)合后，在電解質(zhì)存在時相互凝集成絮片狀團塊，這種試驗稱為凝集試驗（Agglutiation test）。 參與反

17、應的抗原叫凝集原；參與反應的抗體稱為凝集素，主要有IgG、IgM。凝集實驗有直接凝集試驗和間接凝集試驗兩種。,4/1/2024,29,基本原理： 生理鹽水顆粒性抗原 + 相應抗血清 顆粒凝集 (細菌、紅細胞) 比例適合 凝集原 凝集素 過多

18、 后帶現(xiàn)象 （稀釋血清）,,4/1/2024,30,一、直接凝集試驗 顆粒性抗原與相應抗體在電解質(zhì)的參與下，直接結(jié)合，凝集成團的現(xiàn)象，稱直接凝集試驗。按其操作方法可分為玻片發(fā)和試管法。,4/1/2024,31,1．玻片凝集試驗 將已知的抗血清1-2滴，滴于清潔玻片上，取待檢菌液（抗原）加于其上，混合均勻，數(shù)分鐘后可出現(xiàn)顆粒狀或絮片狀凝集，謂之陽性反應。

19、特點：簡單、快速 用途：定性，細菌鑒定、血型鑒定。如用已知的沙門氏菌血清，鑒定沙門氏桿菌的抗原組分以定型。此法也用于畜禽傳染病診斷，如用已知的雞白痢有色平板抗原，檢查雞血清中有無相應抗體，進行雞白痢檢疫,4/1/2024,32,2．試管凝集試驗,是一種定性與定量相結(jié)合的方法。試驗時用一列試管，將待檢血清用0.5%石炭酸生理鹽水作10倍遞進稀釋，每管維持量為0.5ml，一管不加血清作對照。每管中加入一定濃度的抗原0.5ml，混合均

20、勻，在37?C或室溫下靜置數(shù)小時，觀察液體的亮度及沉淀物，視不同的凝集程度記錄為++++（100%菌體凝集），+++（75%凝集），+（25%凝集）。,4/1/2024,33,凡能與一定量抗原發(fā)生50%凝集（++）的血清最高稀釋度，為血清的凝集價或效價（滴度）。在試驗時，必須建立陰性、陽性血清對照管。 特點：準確、耗時 用途：診斷布氏桿菌病，測定抗體的凝集價(定量),4/1/2024,34,二、間接凝集試驗 基本原理： 可

21、溶性抗原+惰性載體（聚苯乙烯乳膠微粒、炭粒、綿羊紅細胞等） 抗原致敏載體 抗原致敏載體+相應免疫血清(抗體) 電解質(zhì) 被動載體凝集(間接乳膠凝集、間接炭素凝集、間接紅細胞凝集等 ),,,4/1/20

22、24,35,特點：敏感(在微量反應板中進行試驗)、快速。用途：用已知抗原致敏的載體可檢測血清中的特異抗體及其效價。 若用已知免疫血清（Ab）致敏的紅細胞，則可檢測病毒等可溶性抗原——稱為反向間接血凝試驗。,4/1/2024,36,,4/1/2024,37,（正向）間接凝集反應原理示意圖,4/1/2024,38,（反向）間接凝集反應原理示意圖,4/1/2024,39,間接凝集抑制反應原理示意圖A：標本中含抗原 B：標本中

23、不含抗原,4/1/2024,40,第四節(jié) 與補體有關的試驗,一、補體的性質(zhì) 補體是存在于正常動物血清中的一組蛋白質(zhì)。 補體沒有特異性，它能與任何抗原抗體復合物相結(jié)合，但不能與游離的抗原或抗體相結(jié)合。 補體與抗原抗體的復合物結(jié)合后，可出現(xiàn)溶血反應、溶菌反應、補體結(jié)合反應、凝集反應、免疫黏膜試驗等。由于補體具有這一特性，故常用其來檢驗抗原或抗體是否發(fā)生特異性結(jié)合，特異性抗原或抗體是否存在。,4/1/2024,4

24、1,二、溶解試驗1.溶血試驗 紅細胞與相應的抗體（溶血素）相結(jié)合后，在補體的參與下，可發(fā)生溶血反應（直接溶血反應），以作補體結(jié)合反應的指示系統(tǒng)。 吸附抗原的紅細胞與抗體結(jié)合后，在補體存在下可以引起溶血反應，這種反應稱為間接溶血反應。間接溶血反應只能用新鮮紅細胞，而新鮮紅細胞不易保存，限制了本法的應用。,4/1/2024,42,2.溶菌試驗 某些細菌（如霍亂弧菌）與抗體結(jié)合后，如有補體存在，可發(fā)生細菌溶解或被殺死

25、，這種反應稱為溶菌反應或殺菌反應。,4/1/2024,43,三．補體參與的試驗—補體結(jié)合試驗 補體結(jié)合試驗是應用可溶性抗原與相應抗體結(jié)合,其抗原抗體復合物可以結(jié)合補體,但這一反應肉眼看不到,如再加入致敏紅細胞,即可根據(jù)是否出現(xiàn)溶血反應判斷反應系統(tǒng)中是否存在相應的抗原和抗體.,4/1/2024,44,1．參與反應：抗原抗體反應系統(tǒng)、補體（豚鼠血清）、指示系統(tǒng)（綿羊紅細胞、溶血素）。2．反應原理：（如下圖所示）。3．特點：敏感性

26、特異性高。 正式試驗前要進行下列測定，操作較繁（溶血素效價、補體效價、抗原效價）。4．用途：用于牛肺疫、副結(jié)核、布氏桿菌病、錐蟲病、馬傳貧、鼻疽等的檢疫。,4/1/2024,45,4/1/2024,46,中和試驗（病毒、毒素中和試驗）原理：病毒與抗血清中抗體特異結(jié)合后失去感染易 感動物、雞或雞胚、細胞活性。例1 NDV 9～11d雞胚 24～48h 雞胚死亡NDV+抗

27、血清 9～11d雞胚 雞胚不死亡,,,,第四節(jié) 中和試驗,,4/1/2024,47,例2 口蹄疫病毒(FMDV) 4～7d乳鼠 乳鼠死亡 FMDV+抗血清 4～7d乳鼠 乳鼠不死亡 用途：1.用已知血清鑒定病毒——診斷病毒病2.用已知病毒檢測血清抗體——診斷病毒感染，測定病毒免疫血清效價（中和價）。,,,,,4/1/2024,

28、48,第六節(jié) 免疫標記技術,免疫標記技術即是將某一個特定的易于檢測的分子或原子，聯(lián)結(jié)在抗體或抗原上，利用抗體（或抗原）能與相應的抗原（或抗體）結(jié)合的特性，從而檢測抗原或抗體的存在及所在部位（定位）。 免疫標記技術是近年來研究血清學反應的一項新技術。它不僅可以用于抗原抗體的定性、定量，還可用于抗原抗體的定位。由于其反應的特異性敏感性高，不但在診斷疾病時廣為應用，亦可應用于生物領域其他方面。,4/1/2024,49,1.熒光

29、標記抗體技術（免疫熒光技術） 免疫熒光技術是將熒光染料標記在抗體球蛋白分子上，制成熒光抗體。當熒光抗體與相應抗原結(jié)合時，就形成帶有熒光的抗原抗體復合物，在熒光顯微鏡下，可觀察到此復合物發(fā)出的熒光?？蓹z測標本中某種抗原的存在或抗原所在的部位（定位）。 原理：熒光素（F）+ Ab AbF(FITC）)

30、 AbF + Ag Ag- AbF Ag- AbF 用途：用AbF檢測抗原 （定性、定位） 特點：敏感，需熒光顯微鏡,,,,紫外光,4/1/2024,50,方法： 直接法 F 間接法

31、 F Ag Ag比較： 檢測一種抗原 標記一種動物的免疫 就須標記特異 球蛋白AbF，就能

32、 的一種AbF 檢測多種抗原 較特異 較敏感,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,4/1/2024,51,2.酶標記抗體技術（酶免疫測定技術）（1） 間接法 （2）雙抗體夾心法原理：用途：已知抗原、酶標 已知血清抗體、酶 抗體測血清抗體

33、 標抗體測抗原,4/1/2024,52,3. 放射免疫測定法原理：Ag+AbR Ag-AbR 或 AgR+Ab AgR-Ab 用液相閃爍儀測R放出的射線量特點：敏感性極高，需高級閃爍儀 同位素對人有放射性危害用途：用于藥物、激素、酶、腫瘤抗原等測定,4/1/2024,53,四、其他免疫標記技術,（一）免疫電鏡技

34、術（二）生物素-親和素標記技術（三）核酸探針技術,4/1/2024,54,第七節(jié) 葡萄球菌A蛋白及其應用,葡萄球菌A蛋白是大多數(shù)金黃色葡萄球菌細胞壁上所含的一種成分，具有多種生物學特性，能與人及多種哺乳動物的IgG的Fc段呈非特異性結(jié)合，結(jié)合后仍保持其抗體活性。同時與酶、熒光顏料偶聯(lián)，因而應用于免疫領域。,4/1/2024,55,一、葡萄球菌A蛋白的主要特性,葡萄球菌A蛋白是金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種成分，存在于細菌表面，結(jié)合于

35、黏肽中。對熱穩(wěn)定，經(jīng)100度1h后仍保持與IgG結(jié)合的活性。 葡萄球菌A蛋白可以與人及多種哺乳動物（如豬、兔、小白鼠）的IgG結(jié)合，并在瓊脂中形成沉淀線。這種結(jié)合是一種假免疫反應，是一種與IgG Fc段非特異的化學結(jié)合，結(jié)合后能激活補體，亦仍保持Fab的免疫活性。這一活性，已應用于免疫學領域中。,4/1/2024,56,二、 葡萄球菌A蛋白在免疫學上的應用,（一）協(xié)同凝集試驗 細胞壁上葡萄球菌A蛋白與抗體結(jié)合，被覆著

36、特異性抗體的金黃色葡萄球菌與相應的抗原結(jié)合時，就可使互相聯(lián)結(jié)引起協(xié)同凝集反應。這種方法應用于多種細菌和某些病毒的快速診斷。 試驗方法常采用玻片法，也可采用試管凝集法，每種方法均應設不含葡萄球菌A蛋白的陰性菌液對照。,4/1/2024,57,（二）標記葡萄球菌A蛋白技術 從富含葡萄球菌A蛋白的菌株中，提取葡萄球菌A成分，用酶、熒光染料標記，代替標記第二抗體，用于檢測抗體或抗原。此法可避免制造第二抗體的麻煩，保存期長