動物營養(yǎng)與飼料科學畢業(yè)論文預答辯-血球蛋白粉來源鑒定及其酶解小肽對斷奶仔豬營養(yǎng)生理效應研究

1、姓名：武艷軍導師：龔道清 教授專業(yè)：動物營養(yǎng)與飼料科學,血球蛋白粉來源鑒定及其酶解小肽對斷奶仔豬營養(yǎng)生理效應研究,2024/2/28,動物科學與技術學院,1,目錄,2024/2/28,動物科學與技術學院,2,研究背景,2024/2/28,動物科學與技術學院,3,1、動物血液制品的生物安全性問題,2024/2/28,動物科學與技術學院,4,一、動物血液及血液制品本身存在一定量的病毒 Polo 等（2005）證實在噴霧干燥

2、血漿和血球蛋白粉中有一定數(shù)量的病毒存在 Roodik等（2006）研究發(fā)現(xiàn)動物血液制品中病毒數(shù)量大于百萬分之一的情況下有傳播疾病的風險 （宰前宰后檢疫、噴霧干燥、超濾納濾、ERP、PRS）二、動物血源管理混亂，易混入牛羊源性成份，增加瘋牛病等疾病傳播機率（中國屠宰前3強：5%，美國屠宰前4強：50%，荷蘭前3強：74%，丹麥最大企業(yè)：80%）,1、動物血液制品的生物安全性問題,2024/2/28,動物科

3、學與技術學院,5,早期斷奶仔豬由于生理和免疫功能發(fā)育不完善，容易受到營養(yǎng)、環(huán)境、心理等多種應激影響而引發(fā)“早期斷奶應激綜合癥(PRAD)”，給畜牧業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。,2、“仔豬早期斷奶應激綜合癥”及其解決方案,圖2 仔豬早期斷奶應激綜合癥,2024/2/28,動物科學與技術學院,6,,2、“仔豬早期斷奶應激綜合癥”及其解決方案,傳統(tǒng)解決方案：抗生素、藥物添加劑（耐藥性、藥物殘留、微生物區(qū)系的破壞）Funderburke（19

4、90）：心理、環(huán)境、營養(yǎng)應激中營養(yǎng)應激最大營養(yǎng)解決方案之一：選用對消化道發(fā)育阻礙小的生物活性物質來配制斷奶仔豬日糧,圖3 生物活性物質,2024/2/28,動物科學與技術學院,7,三、小肽營養(yǎng)在早期斷奶仔豬上的研究進展,斷奶仔豬日糧中添加小肽可顯著提高平均日增重和采食量，降低料重比和腹瀉率，一定程度緩解和治療“早期斷奶應激綜合癥”。王賢勇，王彬，鄭云峰(2006)；張常明(2007)；楊維仁，周紹，祝平等(2008)通過3

5、種方式生產(chǎn)的植物小肽對生產(chǎn)性能和血液生化指標無顯著影響。孫占田等(2007)目前研究較多的是植物小肽，關于動物小肽（血液小肽）還主要停留在工藝研究階段，對于作用機理及最佳添加量研究的很少。,2024/2/28,動物科學與技術學院,8,研究目的,建立一套PCR鑒別動物血球蛋白粉來源的技術研究酶解血球小肽對早期斷奶仔豬的營養(yǎng)生理效應,2024/2/28,動物科學與技術學院,9,試驗一、PCR鑒別動物血球蛋白粉來源方法建立,202

6、4/2/28,動物科學與技術學院,10,牛、雞和混合血球蛋白粉由國家飼料檢測中心武漢分中心提供；豬血球蛋白粉為上海杰隆生物制品有限公司提供；同時還在市場上抽檢部分豬血球蛋白粉樣品。,表1 試驗所用引物序列及擴增片段長度,試驗材料,2024/2/28,動物科學與技術學院,11,試驗結果和分析,1、樣品DNA提取和PCR測序結果,表2 樣品DNA提取和PCR測序結果,飼料中DNA提取方法主要有4種:Chelex法、SDS法、GuSCN

7、法和試劑盒法DNA提取方法在2種物種間是穩(wěn)定的，3對特異性引物可較為準確的擴增出目的片段,2024/2/28,動物科學與技術學院,12,,圖1 檢測靈敏度分析A為豬血球蛋白粉靈敏度檢測；B為雞血球蛋白粉靈敏度檢測；C為牛血球蛋白粉靈敏度檢測；1、2、3、4分別為加入量為1.0 %、0.5 %、0.1 %和0.05 %的血球蛋白粉。,2、靈敏度檢測結果,楊寶華等（2001）采用GuSCN法提取DNA，檢測靈敏度為0.125 %；李林

8、等(2004)使用Promega公司的試劑盒提取DNA，檢測靈敏度為0.001 %本實驗結果：0.05 %（動物源性飼料檢測要求靈敏度≤ 0.1 % ）,2024/2/28,動物科學與技術學院,13,圖2 雞、牛、豬的特異性引物樣品檢測PCR電泳圖1～5是用雞特異引物分別檢測雞、牛、豬、添加1%豬血球蛋白粉的混合血球蛋白粉和添加10%豬血球蛋白粉的混合血球蛋白粉，6～10是用牛特異性引物檢測以上5種血球蛋白粉，11～15是用豬特異

9、性引物檢測以上5種血球蛋白粉。M為分子量標記。,3、特異性檢測結果,試驗中所選用的3對引物可以較為準確的擴增出所需的目的片斷，但是在用牛特異性引物檢驗雞血球粉時，有微弱的陽性。 血球蛋白粉樣品是使用同一個噴霧干燥塔按照先牛后雞的順序生產(chǎn)，制備過程中混雜所致。,2024/2/28,動物科學與技術學院,14,,,圖3 市場產(chǎn)品檢驗結果1～3為用豬、牛、雞引物檢測樣品1，4～6是用豬、牛、雞引物檢測樣品2，7～9是用豬、牛、雞引物檢測樣

10、品3，10～12是用豬、牛、雞引物檢測樣品4，13～15是用豬、牛、雞特異引物檢測樣品5，M為分子量標記。,4、市場產(chǎn)品抽檢結果,,,隨著政府立法對動物源性飼料使用的規(guī)范以及PCR檢測技術的發(fā)展，豬血球蛋白粉中已經(jīng)很少添加反芻動物血球蛋白粉，但仍有部分廠家的產(chǎn)品中會檢測出雞血球蛋白粉。,,,,2024/2/28,動物科學與技術學院,15,試驗二、酶解血球小肽對斷奶仔豬營養(yǎng)生理效應研究,2024/2/28,動物科學與技術學院,16,試驗動

11、物與日糧,選擇35日齡、體重胎次相近的“長×大”二元去勢公豬160頭 基礎日糧由上海高得飼料有限公司生產(chǎn)，基礎日糧組成及營養(yǎng)成分見表1，試驗組日糧為基礎日糧中添加0.5%、1.0%、2.0%的酶解血球小肽，通過制粒工藝加工而成。,表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)成份表,2024/2/28,動物科學與技術學院,17,試驗設計,,,,飼喂28天,每組選擇4頭仔豬采血,,血液生化指標,160頭仔豬隨機分成4組，分別為對照組、0.5%、1

12、.0%、2.0%小肽組，每組4個重復，每個重復10頭仔豬。,,消化道指標,,,小腸形態(tài)指標,,酶活性指標,PH值和器官指數(shù),,對照組和0.5%小肽組各取2只屠宰取樣,,生長性能指標,,,,2024/2/28,動物科學與技術學院,18,試驗結果和分析,表2 酶解血球小肽對斷奶仔豬體重和平均日增重的影響,注：同一行中肩注相同字母者表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，相同大寫字母表示差異

13、極顯著(P<0.01)，下表同。,1、酶解血球小肽對斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響,2024/2/28,動物科學與技術學院,19,圖1 酶解血球小肽對斷奶仔豬平均日增重的影響,曹光辛(1998)鵪鶉、王碧蓮(2001)歐鰻、王賢勇（2007）仔豬研究相一致：合適的小肽添加量可提高生產(chǎn)性能，超過一定限度后生產(chǎn)性能差異不顯著，甚至效果更差。分析：隨著仔豬日齡的增加，過量的小肽在大腸后段發(fā)酵產(chǎn)生氨氣和有毒有害物質，增加仔豬代謝負擔，降低其蛋白

14、利用率，從而影響生產(chǎn)性能。,2024/2/28,動物科學與技術學院,20,圖2 酶解血球小肽在斷奶仔豬日糧中最適添加量,,X=0.623,2024/2/28,動物科學與技術學院,21,表3 酶解血球小肽對斷奶仔豬平均日采食量、料重比和腹瀉率的影響,Miller（1984）、陳代文（1995）、張莉莉（2002）等學者一致認為：仔豬腸道對日糧抗原產(chǎn)生過敏性是導致其腹瀉的原發(fā)性原因。 結果：小肽比植物蛋白有更低的過敏原性，利于斷奶仔豬

15、的吸收利用,2024/2/28,動物科學與技術學院,22,表4 酶解血球小肽對早期斷奶仔豬血液生化指標影響,2、酶解血球小肽對斷奶仔豬血液生化指標的影響,血液生化指標可以反映出機體各組織器管的代謝狀況，間接反映生長性能：TP、ALG：蛋白代謝和免疫力；IgG:介導體液免疫；BUN：蛋白利用率ALT：與增重、飼料利用率呈一定程度正相關；LDH：與動物抗應激能力呈負相關結果：小肽可提高仔豬對蛋白利用率，增強機體免疫力和抗應激能力,2

16、024/2/28,動物科學與技術學院,23,表5 酶解血球小肽對早期斷奶仔豬器官指數(shù)的影響,3、酶解血球小肽對斷奶仔豬消化道指標的影響,結果：小肽組胸腺和頜下淋巴結指數(shù)顯著高于對照組，其它指標差異不顯著分析：脾臟功能繁多，除了是免疫功能外，更是機體最大的濾血器管,2024/2/28,動物科學與技術學院,24,表6 酶解血球小肽對早期斷奶仔豬腸道PH的影響,結果：小肽組和對照組差異不顯著，有一定程度的降低分析：小肽提高仔豬對蛋白的利

17、用率，減少腸道后段蛋白發(fā)酵和NH3產(chǎn)生，降低PH值,2024/2/28,動物科學與技術學院,25,表7 酶解血球小肽對早期斷奶仔豬腸道形態(tài)的影響,結果：小肽組十二指腸絨毛高度，空腸、回腸絨腺比顯著高于對照組，回腸隱窩深度顯著低于對照組。分析：小肽具有生理調節(jié)功能，能有效刺激和誘導小腸組織功能的上升，促進小腸發(fā)育、成熟以及受損腸粘膜細胞的修復。,2024/2/28,動物科學與技術學院,26,表8 酶解血球小肽對早期斷奶仔豬腸道酶活性

18、的影響,1、小肽組十二指腸淀粉酶、胰蛋白酶、蔗糖酶，空腸胰蛋白酶，回腸淀粉酶活性顯著高于對照組。（PH、生理調節(jié)功能）2、脂肪酶差異均不顯著。（日糧脂肪水平影響）3、二糖酶的分布規(guī)律：粘膜高于內容物，而粘膜中又以空腸最高。,2024/2/28,動物科學與技術學院,27,研究結論,本研究建立了一套PCR鑒別動物血球蛋白粉來源的方法，該方法DNA提取結果穩(wěn)定，引物準確性和特異性較好，檢測靈敏度達到0.05%，對今后動物血球蛋白粉

19、來源檢測既可以單獨使用也可以配伍其他方法進行質量控制。在日糧中添加不同水平的小肽，以0.5%小肽組綜合生產(chǎn)性能最佳，通過二次曲線得出斷奶仔豬日糧中小肽最佳添加量為0.623%。在日糧中添加0.5%的小肽可提高仔豬對蛋白質的利用率，促進免疫器官的發(fā)育，增強斷奶仔豬對各種應激和疾病的抵抗力。本試驗條件下，日糧中添加0.5%小肽可以促進腸絨毛的發(fā)育和消化腺的成熟，一定程度上降低腸道的PH值，有利于斷奶仔豬對營養(yǎng)物質的吸收和利用。,