豬丹毒桿菌的檢驗分析

1、實驗六豬丹毒桿菌檢驗,一、實驗?zāi)康?1、學習掌握豬丹毒桿菌檢驗的基本原理和方法；2、了解檢驗豬丹毒桿菌的意義。,二、實驗說明,豬丹毒(Swine erysipelas)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一種人畜共患傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎。 豬丹毒桿菌分為兩個種，即紅斑丹毒絲菌和扁桃體丹毒絲菌

2、，其中僅紅斑丹毒絲菌是具有致病力的毒力種，對豬最易感并有很強的致病性，至今已發(fā)現(xiàn)la, 1b, 2-24和N型共26個血清型，大約80%以上的豬源性分離株屬1型(la和1b)和2型，我國優(yōu)勢血清型也為1a, 1b和2型。,,“大紅袍”,類丹毒,不規(guī)則鮮紅色斑塊,大紫腎 ：典型的敗血脾;腎淤血、腫大,心瓣膜增生 ：疵狀心內(nèi)膜炎的病變，二尖瓣和主動脈瓣出現(xiàn)菜花樣增生物,脾充血腫大,三、檢驗程序,四、操作步驟,（一）增菌 以無

3、菌操作取檢樣，用乳缽加滅菌砂磨碎，無菌操作將樣品轉(zhuǎn)至營養(yǎng)肉湯中，于36℃士1℃培養(yǎng)8 h~10h。（二）分離和培養(yǎng) 對沒有受污染的新鮮病料可直接接種在血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24～48h?；蚪?jīng)TSB肉湯37℃培養(yǎng)24h后，再轉(zhuǎn)種于血液瓊脂或血清瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。,血清瓊脂：菌落特征：細小、圓形、透明、凸起、灰白色、有光澤、質(zhì)軟、露珠樣、易混懸于鹽水中。,血液瓊脂：菌落形態(tài)同血清瓊脂，此外形成綠色的狹窄

4、溶血環(huán)（α溶血）,TSB肉湯：輕度混濁，振動試管呈現(xiàn)出云霧狀，類似試管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌環(huán)。,革蘭氏染色，顯微鏡觀察：分離菌均為革蘭氏陽性桿菌，菌體細長、長短不一，有時呈長絲形，單獨存在，有時呈短鏈或V形排列。,四、操作步驟,（三）生化實驗自TSA瓊脂平板上分別挑取2個以上典型或可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂，先在斜面劃線，再于底層穿刺。以無菌操作將各菌分別穿刺接種至SIM培養(yǎng)基中，將所有試管置于37℃下培養(yǎng)24-

5、48小時。,如試管5：本試驗可觀察乳糖和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣（變黃）；產(chǎn)生硫化氫（變黑）。,四、操作步驟,（三）生化實驗將被檢菌穿刺接種于明膠培養(yǎng)基，于20℃培養(yǎng)7天，逐日觀察明膠液化現(xiàn)象。如室溫高，培養(yǎng)基自行溶化時，可與冰箱內(nèi)放置30分鐘，然后取出觀察結(jié)果，不再凝固時為陽性。V-P試驗、靛基質(zhì)試驗、硝酸鹽還原試驗檢驗。,四、操作步驟,（三）生化實驗,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PC

6、R）,豬丹毒桿菌的檢測步驟1、引物：P1：5'-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3'P2：5‘-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3',豬丹毒桿菌的檢測步驟2、反應(yīng)體系 反應(yīng)總體積為25 μL ，其中含有12.5 μL的PCR Master Mix， 10 μmol/L上、下游引物各1 μL, 1 μg/L DNA模板5 μL ，滅菌雙蒸水6.5 μL

7、 。,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）,豬丹毒桿菌的檢測步驟3、反應(yīng)條件： 95℃，5min 95℃，1min 63℃，1min 40次循環(huán) 72℃，1min

8、 72℃，10min,,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）,豬丹毒桿菌的檢測步驟4、DNA的提取： 將被檢菌株接種于3 mL TSB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)(150 r/min) 10~12h后，取1 mL培養(yǎng)液于1.5 mL離心管中，經(jīng)12000 r/min 4℃離心5 min，棄去上

9、清液，用200μL ddH2O或者TE緩沖液(pH8.0)重懸沉淀，再于沸水浴中10 min，隨后立即在冰中冷卻，然后在12000 r/min及4℃條件下離心5 min，取上清液為豬丹毒桿菌基因組DNA模板。,豬丹毒桿菌的檢測步驟5、電泳檢測：取5μL PCR產(chǎn)物直接經(jīng)1%瓊脂凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠 ）電泳，凝膠成像儀上觀察拍照結(jié)果。,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）,

10、,（四）聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction ，PCR）,四、操作步驟,四、動物實驗1.實驗材料實驗動物：雌性昆明小鼠，體重18~22g 器材：1ml注射器，鼠籠，墊料（所有器皿均經(jīng)高壓消毒）。,四、操作步驟,四、動物實驗2.實驗步驟每組取2只小鼠，以每只0.2mL劑量進行一次性腹腔注射1只，另一只注射0.2mL無菌生理鹽水，觀察，分別記錄小鼠死亡狀況。,四、操作步驟,四、動物實驗3