免疫分析技術(shù)之elisa王娟

1、免疫分析技術(shù)之ELISA,廣東省功能蛋白質(zhì)組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王 娟,免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù),細(xì)胞水平,分子水平,基因水平,,,,體外（或體內(nèi)）測(cè)定各類(lèi)細(xì)胞及其亞群的數(shù)量和效應(yīng)，從而了解機(jī)體的細(xì)胞免疫水平,測(cè)定各類(lèi)免疫球蛋白、補(bǔ)體、細(xì)胞因子及其受體、黏附分子的表達(dá)水平和生物活性，從而了解機(jī)體免疫因子間的相互關(guān)系,測(cè)定免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)與調(diào)控、免疫分子的遺傳多態(tài)性及基因型別分析,ELISA 概念,酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked I

2、mmuno Sorbent Assay，ELISA）， 是在免疫酶技術(shù)(immunoenzymatic techniques) 上發(fā)展起來(lái)的一種新型免疫測(cè)定技術(shù)，基礎(chǔ)是：抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。,酶免疫測(cè)定類(lèi)型,這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA。,1.1　抗原

3、抗體反應(yīng),1.1.1　可逆性,抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab抗體的親和力（affinity），可以用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] ，Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。,1.1.2　特異性,抗原抗體的

4、結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。,,1.1.3　敏感性,化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10μg/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。,1.2　免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

5、由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。,基本原理,①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。③在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法

6、使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。④由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。,2　ELISA的類(lèi)型,ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1）固相的抗原或

7、抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱(chēng)為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類(lèi)型的檢測(cè)方法。,2.1　雙抗體夾心法測(cè)抗原,A.      將抗體吸附于固相表面；B.      加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物；

8、C.     加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。底物的降解量＝抗原量。,此法適用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。,2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體,用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg的檢測(cè)常

9、采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。,2.3 間接法測(cè)抗體,傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。,A.      將抗原吸附于固相載體表面；B.      加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C.   

10、0;  加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。 測(cè)定底物的降解量＝抗體量,2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體,當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。,2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原,小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈

11、淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。,2.6 捕獲包被法測(cè)抗體,,,,IgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgM（其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期診斷。,2.7 ABS-ELISA法,①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG （Biotin）；⑤：辣根過(guò)氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥

12、：DAB顯色液；⑦：顯色；,3. ELISA的試劑(A、B、C三部分),ELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液,ELISA的試劑準(zhǔn)備A,固相載體 聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗

13、原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。聚氯乙烯，聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。,3.1.2 　包被的方式,,將抗原或抗體固定的過(guò)程稱(chēng)為包被(coating)。 蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的

14、分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。,不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加

15、入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。,天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。,3.1.3 　包被用抗原,3.1.4 　包被用抗體,IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體

16、結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液，須除去雜抗體后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。,3.1.5 　包被的條件,pH 9.6碳酸鹽緩沖液 pH 7.2的磷酸鹽緩沖液 pH 7-8的Tris-HCL緩沖液 加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)。

17、包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。,3.1.6 　封閉,封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。常用封閉劑：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5

18、%）。 所有的ELISA固相均需封閉？,ELISA的試劑準(zhǔn)備B,3.2 　結(jié)合物,即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性,3.2.1 　結(jié)合物用的抗原和抗體,制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物

19、均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。,,3.2.2　酶,純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。辣根過(guò)氧化物酶HRP是一種糖蛋

20、白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。,酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較

21、高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效.,3.2.3 結(jié)合物的制備,結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件

22、和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。,酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。,3.2.4 結(jié)合物的保存,用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐溫20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行

23、稀釋?zhuān)?-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。,3.2.5 結(jié)合物的稀釋,試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物,3.3 　酶的底物,3.3.1 　HRP的底物,OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。,TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為45

24、0nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)。,AP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

25、,4 對(duì)照設(shè)定,陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱(chēng)；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。,參考標(biāo)準(zhǔn)品定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)

26、包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。,陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。,5 標(biāo)本的采取和保存,體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以

27、HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。,加樣在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。,基本操作注意事項(xiàng),保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有4

28、3℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。,洗滌洗滌在ELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)?？梢哉f(shuō)在ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵

29、技術(shù)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：,（1）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。（2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含

30、親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。,顯色,顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至2小時(shí)后即可完全

31、消退至無(wú)色。,比色,拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（oplical density，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫(xiě)于

32、A字母的右下角，如OPD的吸收波長(zhǎng)為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。,酶標(biāo)比色儀,酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISA光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作

33、時(shí)室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書(shū)。,6 結(jié)果判斷,6.1 定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有”或“無(wú)”的回答，分別用“陽(yáng)性”、“陰性”表示。在這種半定量測(cè)定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗(yàn)，呈陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的

34、強(qiáng)弱，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性更具定量意義。在間接法和夾心法ELSIA中，陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類(lèi)反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同，分述于下。,A.陽(yáng)性判定值： （cut-off value）一般為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù)(0.05)，以此作為判斷結(jié)果陽(yáng)性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。B.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。在得

35、出標(biāo)本（S）和陰性對(duì)照（N）的A值后，計(jì)算S/N值,。,間接法和夾心法,（2）競(jìng)爭(zhēng)法,因肉眼很難辨別弱陽(yáng)性反應(yīng)與陰性對(duì)照的顯色差異，一般均用比色計(jì)測(cè)定，讀出S、P和N的吸光值?！　. 陽(yáng)性判定值法 陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX　　 陽(yáng)性 A≤陽(yáng)性判定值　　 陰性 A＞陽(yáng)性判定值 b. 抑制率法 　抑制率（%）= （陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）

36、5;100%/陰性對(duì)照 陽(yáng)性 抑制率≥50%為 陰性 ＜50%,4.7.2 定量測(cè)定,ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多，特別是固相載體的包被難達(dá)到各個(gè)體之間的一致，因此在定量測(cè)定中，每批測(cè)試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈S形，其頭、尾部曲線趨

37、于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。,4. ELISA的操作要點(diǎn),嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，優(yōu)質(zhì)的試劑，正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。嚴(yán)格遵照規(guī)定操作，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果。,,,免疫分析技術(shù)之液相芯片技術(shù)及應(yīng)用,廣東省功能蛋白質(zhì)組重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室王 娟,,,liquichip 液相芯片系統(tǒng)___,液相芯片系統(tǒng)有機(jī)地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、激光技術(shù)、流體學(xué)、最

38、新的高速數(shù)字信號(hào)處理器和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了Luminex 100無(wú)與倫比的檢測(cè)特異性和靈敏度。,Benefits,Applications,Future,Technology,Principle,Most bioassays consist of two or more biomolecules interacting,Principle,Using LiquiChip-Technology these biological i

39、nteractions take place on small, microscopical beadsthese beads are fluorescent (red ),Principle,Detection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagents,Beads球形基質(zhì),Capture m

40、olecule探針?lè)肿?Analyte待檢測(cè)物,Reporter molecule報(bào)告分子,,,,Assays on Uniform Polystyrene(聚苯乙烯) Beads,Diameter 5.6 µm,Two internal Dyes for Bead Classification,,,Defined Mixture Dying in Shrinking in of both Dy

41、es Organic Solvent Aqueous Solvent,Two-Color Bead-Coding,Based on xMAP technologyBy using 10 different levels of each of two fluorescent dyes, an array of 100 beads, each with a unique color signature, is creat

42、ed,為了便于探針?lè)肿拥墓潭?，在球形基質(zhì)的表面進(jìn)行了一系列的修飾，可適合各種蛋白，肽，核酸等生物分子的固定,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,“Liquid Array” Technology,Differen

43、t bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a single well,“Liquid Array” Technology,Different bead codes (colors) are used to allow the identification of multiple reactions in a si

44、ngle well,反應(yīng)主要包括3個(gè)步驟,探針?lè)肿拥墓潭▽⑦@種標(biāo)記好探針的球形基質(zhì)與樣品反應(yīng)。探針可以與相應(yīng)的目的分子特異性的結(jié)合，帶有綠色報(bào)告熒光的報(bào)告分子與目的分子特異性的結(jié)合，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行定量反應(yīng)結(jié)果的檢測(cè),LiquiChip Workstation,Flow cytometer-based technologyMeasures fluorescenceComponents:ReaderMicroplate Handle

45、rFluid Module,Flow Cytometer based Analysis,Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusingTwo lasers are used for excitation of fluorescence,Principle of Detection,The red laser is used to identify

46、the bead codeThe green laser is used to identify the reporter signal,利用這100種球形基質(zhì)，可以標(biāo)記上100種不同的探針?lè)肿?，同時(shí)對(duì)一個(gè)樣本中的100種不同的目的分子進(jìn)行檢測(cè)。,,A,F,H,E,B,G,C,D,,Benefits,系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn),靈活性好，可適用于各種蛋白質(zhì)分析，可以接受實(shí)驗(yàn)室已有的實(shí)驗(yàn)方案，使用者可以自行設(shè)計(jì)分析方案，也可使用成套試劑盒 

47、通量大，可對(duì)同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析；在35-60分鐘內(nèi)可對(duì)96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測(cè)液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測(cè)物的反應(yīng)靈敏度高，信噪比好，只需要微量的樣品即可進(jìn)行檢測(cè)操作簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，成本低,,,,Liquichip和ELISA靈敏度的比較分別用ELISA和liquichip 對(duì)硫氧還蛋白進(jìn)行定量測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線I：使用liquichip測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線II、III：使用

48、ELISA測(cè)定得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線,,,,Compared to ELISA:,樣本需求量小: EL ISA 每次實(shí)驗(yàn)均至少需要100～200μl 外周血，而采用液相芯片只需50μl 血液即可在一支試管中完成所有檢測(cè)項(xiàng)目,總體可節(jié)約80 %以上的樣本，這對(duì)外周血極難提取的早產(chǎn)新生兒尤有意義; 操作流程簡(jiǎn)化:由于EL ISA 工作曲線的置信區(qū)間僅2～3 對(duì)數(shù)級(jí)，因而對(duì)于較高濃度的細(xì)胞因子的檢測(cè),其樣本必須經(jīng)不同程度的稀釋以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)精確度，而液

49、相芯片采用熒光分析，其置信區(qū)間可達(dá)4～5 對(duì)數(shù)級(jí)，活性范圍可10 倍于EL ISA ,從而省略了繁瑣的稀釋和洗滌步驟; 高效性:液相懸浮狀態(tài)下更有利于蛋白質(zhì)間的空間結(jié)合，其結(jié)合效率大大高于EL ISA 固相沉底。,Measuring the level of many human or mouse cytokines in a single sample,Ready-to-use Broad-Range Kinase kits for

50、 measuring kinase activity,Ser/Thr Kinase, Tyr Kinase Kit Kinase/Phosphorylated Protein,no washing steps faster higher throughput quantitative assay results no hazardous gels / radioactivity Sensitivity: higher tha

51、n ECL/colorimetric assays, comparable to or better than radioactive assays,Advantages compared to Western blot procedures,Applications,When to use the LiquiChip System?,The LiquiChip System is used for a large variety o

52、f protein assays:ImmunoassaysEnzyme AssaysProtein-protein interaction AssaysReceptor ligand AssaysProtein nucleic acid assays,Assay Types,Immunoassays,Enzyme assays (kinase, protease),DNA-hybridization assays,Inte

53、raction assays,Realize the Power of Suspension Arrays,Assay system that offers:multiplexing of assays up to a factor of 100a mix-and-measure procedures (no washing)suspension enzyme assays (kinase, phosphatase and pro

54、tease assays),,,A utoimmune,ASCA Human  beta-2 Microglobulin Human  Mouse  Centromere B Human  Chromatin Human  ENA Profile 4 (SSA, SSB, Sm, RNP) Human  ENA Profile 5 (SSA, SSB, Sm, RNP

55、, Scl-70) Human  ENA Profile 6 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1) Human  Histone Human  Histone H1 Human  Histone H2A Human  Histone H2B Human  Histone H3 Human  Histone H4 Human&

56、#160; HSP-27 pS82 General  HSP-27 Total General  HSP-32 Human  HSP-65 Human  HSP-71 Human  HSP-90 a Human,HSP-90 b Human  Jo-1 Human  PCNA Human  Mouse  PR3 Human

57、0; PR3 (cANCA) Mouse  Ribosomal P Human  Mouse  RNP Human  Mouse  RNP-A Human  RNP-C Human  SCF Human  Mouse  Scl-70 Human  Mouse  Serum Amyloid P Human 

58、; SLE Profile 8 (SSA, SSB, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribosome-P, chromatin) Human  Sm General  Human  Smith Mouse  Human  SSA Human  Mouse  SSB Human  Mouse  Streptolysin O

59、 Human  TPO Human  Mouse,Allergy Testing,Alternaria (Mold) Human  Bermuda Grass Human  Cat Dander Human  Egg White Human  Milk Human  Mite Pternoyssinus Human  Mountain Ceda

60、r Human  Short Ragweed Human  Timothy Grass Human  Wheat (food) Human,Cancer Markers,alpha Fetoprotein Human  Cancer Antigen 125 Human  Carcinoembryonic Antigen Human  PSA, Free Human,

61、Cardiac Markers,Creatine Kinase-MB Human  Endothelin-1 Mouse  PAP Human  SGOT Human  Mouse  TIMP-1 Human  Mouse,Cytokines,BDNF Human  CREB pS133 General  CREB Total General&#

62、160; DR-5 Human  EGF Human  Mouse  ENA-78 Human  Eotaxin Mouse  Human  Fatty Acid Binding Protein Human  FGF-basic Human  Mouse  G-CSF Human  Mouse  GCP-2 Mo

63、use  GM-CSF Human  Mouse  Rat  GRO-KC Rat  HGF Human  Mouse  ICAM-1 Human  IFN-alpha Human  IFN-gamma Human  Mouse  Rat  IL-10 Human  Mouse  Ra

64、t  IL-11 Mouse  IL-12 Human  Mouse  IL-12 p40 Human  Mouse  IL-12 p40/p70 Mouse  Rat  IL-12 p70 Human  Mouse  Rat  IL-13 Human  Mouse  IL-15 Human&#

65、160; Mouse  IL-16 Human  IL-17 Human  Mouse,IL-18 Rat  IL-1alpha Mouse  Human  Rat  IL-1beta Human  Mouse  Rat  IL-1ra Human  IL-1ra/IL-1F3 Human  IL-2 H

66、uman  Mouse  Rat  IL-3 Human  Mouse  IL-4 Human  Mouse  Rat  IL-5 Human  Mouse  IL-6 Human  Mouse  Rat  IL-7 Human  Mouse  IL-8 Human 

67、 IL-9 Mouse  IP-10 Human  Mouse  JE/MCP-1 Mouse  KC Mouse  KC/GROa Mouse  LIF Mouse  Lymphotacin Human  Mouse  M-CSF Mouse  MCP-1 Human  Mouse  Rat

68、0; MCP-1(MCAF) Human  MCP-3 Mouse  MCP-5 Mouse  MDC Human  Mouse,MIG Human  Mouse  MIP-1 alpha Human  Mouse  MIP-1 beta Human  Mouse  MIP-1 gamma Mouse  MIP-

69、2 Mouse  MIP-3 beta Mouse  OSM Mouse  PDGF-BB Mouse  RANTES Human  Mouse  Rb (pT821) Human  Rb (total) Human  Rb pSpT249/252 Human  Tau (pS214) Human  Tau (pS396

70、) Human  Tau (total) Human  Tissue Factor Human  Mouse  TNF-alpha Human  Mouse  Rat  TNF-beta Human  TNF-RI Human  TNF-RII Human  VCAM-1 Mouse  VEGF Human

71、60; Mouse,Endocrine,Adiponectin Human  Rat  Amylin Mouse  Rat  Human  C-Peptide Human  Calcitonin Human  CRF Human  FGF-9 Mouse  GLP-1 Human  Mouse  Rat 

72、Glucagon Mouse  Rat  Human  Growth Hormone Human  Mouse  Insulin Human  Mouse  Rat  Leptin Human  Mouse  Rat  Lipoprotein (a) Human  Resistin Human 

73、Mouse  Rat  T3 Human  T4 Human  TBG Human  Thyroglobulin Human  TSH Human,Genotyping,FlexMAP? General  Mitochondrial DNA Screening General  Tag-It? Mutation Detection Kit Ge

74、neral  Y-SNP Identification General,Infectious disease,Adenovirus Human  Mouse  Bordetella pertussis Human  Campylobacter jejuni Human  Chlamydia pneumoniae Human  Chlamydia trachomatis

75、 Human  Cholera Toxin Human  Cholera Toxin b Human  Clostridium piliforme (Tyzzer's) Mouse  Cytomegalovirus Human  Mouse  Diphtheria Toxin Human  Ectromelia virus Mouse 

76、EDIM (Epidemic diarrhea of infant mice) Mouse  Encephalitozoon cuniculi Mouse  Epstein-Barr EA Human  Epstein-Barr NA Human  Epstein-Barr VCA Human  HBV Core Human  HBV Envelope Human

77、  HBV Surface (Ad) Human  HBV Surface (Ay) Human  HCV Core Human  HCV NS3 Human  HCV NS4 Human  HCV NS5 Human  Helicobacter pylori Human  Hepatitis A Human  Hepatitis