系列逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記的建立及其在柿屬植物中的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究首先分離柿Tv1-copia類逆轉(zhuǎn)座子RNaseH-LTR序列并設(shè)計逆轉(zhuǎn)座子引物，其次建立柿屬植物IRAP、REMAP、SSAP和ISTR系列逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)體系并應(yīng)用于柿屬植物種質(zhì)鑒定和親緣關(guān)系分析等方面，同時應(yīng)用非逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記AFLP和DAMD于柿屬植物，并比較了二者以及ISTR與柿屬特異性逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記在該屬植物遺傳分析中的性能，此外，對柿逆轉(zhuǎn)座子引物在它類果樹物種及禾本科、茄科和薔薇科已發(fā)表的逆轉(zhuǎn)座子引物在果樹類

2、作物上的通用性進行研究，并對一份特殊種質(zhì)‘90-1-10’進行了鑒定。主要結(jié)果如下：
　　 1．利用抑制PCR方法從‘羅田甜柿’（Diospyros kaki Thunb．‘Luotiantianshi’）基因組中分離31條Tv1-copia類逆轉(zhuǎn)座子的RNaseH-LTR序列，序列分析表明：至少有10個逆轉(zhuǎn)座予家族得到擴增；其家族間序列普遍表現(xiàn)高度異質(zhì)，發(fā)生不同程度的堿基替換、插入或缺失突變，以及翻譯成氨基酸后的終止密碼子突變

3、、氨基酸取代和移框突變等；家族內(nèi)部某些序列相似性極高，類反轉(zhuǎn)錄病毒中的準(zhǔn)種居群；序列LTR區(qū)含有啟動子的結(jié)構(gòu)特征“CAAT box”、“FATA box”以及受不同脅迫條件作用下的調(diào)控元件。序列投遞GenBank，登錄號為EU068698-EU068728。
　　 2．基于其中15條RNaseH-LTR（Long terminal repeat）序列共設(shè)計26條逆轉(zhuǎn)座子引物，包括8條正向LTR引物、10條反向LTR引物和8條PP

4、T（polypurine tract）引物。為增加特異性，引物設(shè)計過程中充分考慮其較長長度和高Tm值：長度均在20bp～26bp之間，平均23bp；Tm值普遍高于55℃，平均為60.2℃。其中24條引物表現(xiàn)較好。
　　 3．優(yōu)化PCR反應(yīng)體系各組分濃度、退火溫度（Tm）和擴增程序的基礎(chǔ)上建立起適合柿屬植物的逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記RAP（Inter-retrotransposon amplified polymorphism，逆轉(zhuǎn)座子之

5、間擴增多態(tài)性）和REMAP（Retrotransposon-microsatellite amplified polymoiphism，逆轉(zhuǎn)座子-微衛(wèi)星擴增多態(tài)性）PCR擴增技術(shù)體系：20μL反應(yīng)體系中，含1×Buffer、模板DNA50 ng、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs0.25 mmol/L、引物0.40μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U，礦物油20μL；PCR擴增程序：95℃5 min；95℃1 min；56

6、℃1 min ramp+0.6℃/s；72℃2 min，循環(huán)44次；72℃延伸8 min。
　　 4．建立柿屬SSAP（Sequence-specific amplified polymorphism，特異序列擴增多態(tài)性）逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記技術(shù)體系，并對可能影響其擴增性能的幾個重要因素和不同逆轉(zhuǎn)座子在柿屬種質(zhì)遺傳關(guān)系研究中的特點進行分析比較。結(jié)果表明，所有逆轉(zhuǎn)座子都產(chǎn)生豐富的多態(tài)性，表明每個逆轉(zhuǎn)座子都可單獨用于SSAP分析；SSA

7、P擴增性能與逆轉(zhuǎn)座子自身的特點、選擇性擴增酶接頭引物的種類、組成及排序相關(guān)；不同逆轉(zhuǎn)座子在28份試材中表現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)座特點。研究為進一步使用多逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記，以獲得較為全面的柿屬種質(zhì)起源進化信息和進行遺傳多樣性評價及種質(zhì)鑒定提供技術(shù)支持。
　　 5．建立適合柿屬植物的通用引物逆轉(zhuǎn)座子ISTR（Inverse sequence-tagged repeat，反向序列標(biāo)簽重復(fù)）分子標(biāo)記體系，與IRAP同時用于32份柿屬基因型的多態(tài)性和

8、親緣關(guān)系分析，并比較二者分析性能。結(jié)果表明，IRAP和ISTR均能很好的用于柿屬植物的遺傳分析；IRAP能區(qū)分供試所有基因型，包括芽變；ISTR不能區(qū)分‘富有’和其芽變‘松本早生’，但可以區(qū)分其它所有基因型；IRAP與ISTR的聚類結(jié)果基本一致，但在細(xì)節(jié)上存在差異；IRAP在種間及種下分析所得的所有參數(shù)值（平均每次實驗擴增總位點數(shù)、平均每次實驗擴增多態(tài)位點數(shù)、多態(tài)位點百分率Pi、多樣性指數(shù)DI、有效多重系數(shù)EMR、標(biāo)記指數(shù)Marker

9、Index MI）均高于ISTR，總的來看，具有柿屬特異性的IRAP標(biāo)記系統(tǒng)的分析性能優(yōu)于通用引物的ISTR。
　　 6．探討IRAP用于柿屬植物種間關(guān)系研究的可行性，并與小衛(wèi)星分子標(biāo)記DAMD（Directed amplification of minisatellite-region DNA，直接擴增小衛(wèi)星DNA）進行多態(tài)性和聚類分析比較。結(jié)果表明IRAP可以很好的用于柿屬種間親緣關(guān)系研究；DAMD作為首次應(yīng)用于柿屬植物的標(biāo)

10、記類型，也表現(xiàn)出很好的擴增性能，并能區(qū)分芽變；IRAP和DAMD聚類基本均能將不同采集地的種按地理位置聚類，但對中國熱帶、亞熱帶采集的柿種與溫帶栽培柿之間的關(guān)系存在分歧；兩種標(biāo)記用于柿屬植物種間親緣關(guān)系研究，在多態(tài)性水平、平均擴增總位點等方面表現(xiàn)相當(dāng)，然而綜合擴增性能評價IRAP較優(yōu)于DAMD。
　　 7．探討IRAP用于品種內(nèi)微小變異檢測的性能，以我國最大的‘磨盤柿’產(chǎn)區(qū)-北京市房山區(qū)張坊鎮(zhèn)上報的11株磨盤柿基因型作為試材，這

11、些試材在成熟期、果實外觀形態(tài)、抗性及耐貯性等方面性狀與標(biāo)準(zhǔn)品種存在差異。結(jié)果表明，19個逆轉(zhuǎn)座子單引物IRAP擴增中，4個引物（PPT3，PPT6，SAF5和SAR10）在磨盤柿變異間具多態(tài)性，采用二歧法，該4個引物可將11份‘磨盤柿’變異完全區(qū)分；UPGMA聚類圖上，磨盤柿變異與標(biāo)準(zhǔn)磨盤柿緊密相聚，分支模式顯著不同于種與種間及不同品種之間；相似系數(shù)計算表明，磨盤柿變異單株間的相似指數(shù)在0.90（‘MP2’與‘MP4’、‘MP8’、‘M

12、P9’）～0.98（‘MP7’和‘MP8’）之間，平均0.94，與磨盤柿標(biāo)準(zhǔn)品種‘BZMP’的平均相似指數(shù)為0.91，大于種間和品種間相似水平，與芽變間的相似水平接近?？偟目磥恚狙芯胯b定了供試的11份北京房山區(qū)磨盤柿的變異為遺傳物質(zhì)的改變，并非飾變；11份基因型之間以及與標(biāo)準(zhǔn)磨盤柿品種在遺傳上的高相似性表明，它們可能為磨盤柿的芽變類型；IRAP分子標(biāo)記能夠很好的區(qū)分遺傳背景高度相似的微小變異，反映了該項技術(shù)是今后進行柿品種鑒定，尤其是

13、遺傳差異較為接近的基因型，如芽變的有效工具。
　　 8．IRAP、REMAP和SSAP逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記用于28份柿屬植物種質(zhì)鑒定，16個柿逆轉(zhuǎn)座子引物在供試材料的單引物IRAP分析中檢測到豐富的擴增位點，且高多態(tài)性比例（97.6％）；篩選出的7對REMAP引物和25對SSAP引物在相應(yīng)的分子標(biāo)記內(nèi)同樣檢測到豐富的多態(tài)性（分別為95.2％和93.4％）；每一類型分子標(biāo)記均可成功鑒定28份種質(zhì)，其中2個IRAP引物（PPT3和SAR

14、10）及4對SSAP引物（SAR10/EA06、SAR9/MC03、SAR9/MC11、SAR1/MC11）可以單獨用于區(qū)分全部種質(zhì)。進一步計算形態(tài)學(xué)相近和已知芽變關(guān)系的5組種質(zhì)各組內(nèi)基因型間的遺傳距離，量化每種逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記的鑒別效率表明：IRAP為3種逆轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記中進行種質(zhì)鑒別最為靈敏的標(biāo)記類型。
　　 9．IRAP、REMAP、SSAP和AFLP（Amplified fragment length polymorph

15、ism，擴增限制性片段長度多態(tài)性）4種分子標(biāo)記在柿屬植物遺傳關(guān)系研究中的應(yīng)用效果比較表明：IRAP具有最高的多態(tài)性水平和多樣性指數(shù)；AFLP的多態(tài)性低于IRAP和SSAP，但具有最高的標(biāo)記指數(shù)；SSAP的標(biāo)記指數(shù)值低于AFLP，但其多態(tài)性高于AFLP；4種分子標(biāo)記的遺傳相似系數(shù)矩陣間的相關(guān)性顯著，相對而言REMAP可靠性略差；4種分子標(biāo)記的聚類結(jié)果基本一致，均可將28份種質(zhì)按種間及種下不同地理起源進行劃分，然而聚類細(xì)節(jié)因標(biāo)記種類不同有別

16、。
　　 10．從‘羅田甜柿’中開發(fā)的26個逆轉(zhuǎn)座子引物在其它果樹上的通用性試驗表明：53.85％的引物可在供試果樹類植物中獲得擴增產(chǎn)物，但不同引物在不同物種中的通用性各異，其中在柿屬、葡萄屬、柑橘類和桃屬植物中的通用性較好。利用可通用引物在柿屬、柑橘類、葡萄屬、桃屬和梨屬植物中的IRAP數(shù)據(jù)進行遺傳關(guān)系分析的結(jié)果表明：這些引物在相關(guān)試材上還具有種質(zhì)區(qū)分、親子關(guān)系鑒定、分類和系統(tǒng)關(guān)系研究以及遺傳多樣性評價等研究的潛力；同時還研究

17、了已發(fā)表的來自薔薇科、禾本科和茄科的逆轉(zhuǎn)座子引物在果樹類作物上的通用性，進一步佐證了逆轉(zhuǎn)座子引物可跨物種通用的特點，不同意前人的觀點。
　　 11．我國原產(chǎn)柿種質(zhì)中只有完全甜柿和完全澀柿兩種類型，至今尚無不完全甜柿存在的報道。對引種自湖北省羅田縣的‘90-1-10’進行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)鑒定及生化和分子水平分析，結(jié)果表明，‘90-1-10’具有與中國原產(chǎn)柿種質(zhì)相近的果實特征，結(jié)合4種DNA分子標(biāo)記IRAP、REMAP、SSAP和AF