表達(dá)雞傳染性支氣管炎病毒S1和N蛋白重組腺病毒構(gòu)建及免疫特性研究.pdf

1、雞傳染性支氣管炎(Avian Infectious Bronchitis,IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病。IBV易變異且血清型眾多,各血清型毒株間沒(méi)有或僅有很小的交叉保護(hù)性,給該病的防治帶來(lái)很大困難。
　　 疫苗免疫接種是預(yù)防和控制該病較為有效的措施之一。傳統(tǒng)疫苗包括滅活苗和減毒活疫苗存在許多不足如減毒疫苗的安全性

2、差、有毒力返強(qiáng)的潛在危險(xiǎn)以及保存條件苛刻等；滅活疫苗存在免疫力不持久,用量大且制備過(guò)程復(fù)雜,費(fèi)用較高等缺點(diǎn)。因此,開(kāi)發(fā)新型疫苗如亞單位疫苗、病毒活載體疫苗、DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物可食用疫苗等逐漸成為疫苗領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。
　　 本研究以人5型腺病毒(Ad5)為載體,以IBV地方分離株(CK／CH／LHLJ／04V)有效免疫原基因S1和N基因?yàn)橥庠床迦氚谢?通過(guò)細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建了兩株分別表達(dá)IBV S1和N蛋白的重組腺病毒

3、,分別命名為rAd-S1和rAd-N。通過(guò)PCR鑒定、間接免疫熒光及Westernblot檢測(cè)證實(shí)S1和N蛋白在重組腺病毒中均獲得表達(dá)。對(duì)重組腺病毒分別傳代至15代,分別提取第8代、第10代、第12代和第15代重組毒基因組,通過(guò)PCR、序列測(cè)定表明,插入的外源基因遺傳性穩(wěn)定。對(duì)構(gòu)建的重組腺病毒和親本腺病毒的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析表明,該兩株重組腺病毒的毒價(jià)均達(dá)到1010TCID50／mL,而且重組腺病毒與親本毒在生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方面無(wú)顯著差異。

4、>　　 為進(jìn)一步研究表達(dá)IBV S1、N蛋白重組腺病毒免疫學(xué)特性,采用兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià):一是重組毒免疫雞,檢測(cè)抗體應(yīng)答水平;二是免疫保護(hù)試驗(yàn)。將55只SPF雞平均分成五組,每組11只,分別記為A組、B組、c組、D組和E組。前三組為實(shí)驗(yàn)組,后兩組為對(duì)照組。在雞3日齡時(shí)開(kāi)始免疫,A、B組分別免疫重組毒rAd-S1、rAd-N。C組3日齡時(shí)先用重組毒rAd-N首免,7天后用rAd-S1加強(qiáng)免疫一次。免疫途徑為肌肉注射,免疫劑量均為200μL

5、(1010TCID50／mL)。D組為疫苗株LDT3-A免疫組,滴鼻免疫,使用劑量為100μL(106EID50／mL),E組為親本腺病毒免疫組。各組首免后分別于第5d、10d、15d和20d采集血清以檢測(cè)抗體水平。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,疫苗免疫組能夠檢測(cè)到一定水平的抗體,且在免疫后第15天其OD630值達(dá)到高峰,最高值達(dá)0.8。試驗(yàn)組采用Western blot方法檢測(cè),分別裂解各重組腺病毒rAd-S1、rAd-N作為抗原,檢測(cè)各組

6、內(nèi)每只雞免疫后抗體產(chǎn)生情況。裂解IBV全病毒作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示,重組腺病毒免疫組在首免后第15天和第20天均有一定數(shù)量的雞只分別產(chǎn)生了針對(duì)S1和N蛋白的抗體,而親本腺病毒免疫組沒(méi)有雞產(chǎn)生抗體。首免后第21天用IBV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒并連續(xù)觀(guān)察25天。試驗(yàn)結(jié)果顯示,攻毒后A組、B組、C組、D組和E組的發(fā)病率分別為:27.3％、54.5％、63.6％、0、100％,各組死亡率分別為:18.2％、45.5％、54.5％、0、81.8％。