Cdc25B mRNA在雞十二指腸粘膜的表達(dá)——核酸原位雜交法.pdf

1、雞是發(fā)育生物學(xué)中重要的研究模式生物之一，對(duì)其保守基因結(jié)構(gòu)和功能的研究不但可以闡述其在發(fā)育生物學(xué)中的作用，而且得到的結(jié)果還可運(yùn)用到人和哺乳動(dòng)物疾病的預(yù)防和控制上。CDC25磷酸激酶家族是一類在生物進(jìn)化過(guò)程中高度保守的細(xì)胞周期調(diào)控因子，調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育；同時(shí)在成體中CDC25的異?；罨瘯?huì)導(dǎo)致人類一系列高發(fā)性腫瘤的發(fā)生。近年來(lái)對(duì)CDC25B磷酸激酶的研究成為發(fā)育生物學(xué)和腫瘤醫(yī)學(xué)的一個(gè)熱點(diǎn)，許多研究認(rèn)為它與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后有關(guān)，檢測(cè)

2、Cdc25B的表達(dá)有望成為判斷腫瘤細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和增殖能力一個(gè)可靠的分子指標(biāo)。本試驗(yàn)應(yīng)用自行合成的地高辛標(biāo)記的RNA探針在雞成體組織上進(jìn)行原位雜交的方法，檢測(cè)Cdc25B基因轉(zhuǎn)錄體在雞十二指腸粘膜的表達(dá)情況，以期探明禽類腸道上皮增殖規(guī)律和功能分區(qū)，并能與哺乳動(dòng)物中Cdc25B在成體組織上的表達(dá)情況進(jìn)行比較，為研究禽類消化特征和發(fā)育的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研究CDC25B的致瘤機(jī)理以及合成其抑制劑提供一定的理論依據(jù)。
　　

3、試驗(yàn)ⅠCdc25B mRNA探針的合成
　　 應(yīng)用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件，以Gene Bank中登陸序列號(hào)為AJ720997的雞Cdc25B mRNA序列為參照設(shè)計(jì)引物。提取孵育36h雞胚胎的總RNA，通過(guò)RT-PCR及PCR從雞的總RNA中擴(kuò)增Cdc25B目的基因片段，將目的DNA純化回收后，用TA克隆的方法將目的片段克隆到pGM-easy T載體中然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆，測(cè)序鑒定目的片段。分別利用pGM-T

4、easy質(zhì)粒中T7和SP6啟動(dòng)子及T7和SP6RNA聚合酶，以線性化的Cdc25B/pGM-T easy為模板轉(zhuǎn)錄合成正、反義DIG標(biāo)記的RNA探針。迅速將合成好的DNA探針進(jìn)行純化，然后用分光光度計(jì)測(cè)定探針的標(biāo)記效率和濃度，正反義探針濃度均接近200ng/μl，電泳結(jié)果表明探針成功合成，可進(jìn)一步應(yīng)用于ISHH試驗(yàn)。
　　 試驗(yàn)Ⅱ雞十二指腸粘膜上皮Cdc25B的原位雜交反應(yīng)
　　 通過(guò)原位雜交（in situ hybri

5、dization histochemistry， ISHH）技術(shù)，用實(shí)驗(yàn)Ⅰ合成的探針探查Cdc25B mRNA在雞十二指腸粘膜上皮中的分布情況。結(jié)果表明，成年雞十二指腸腸腺上皮細(xì)胞中有豐富的Cdc25B mRNA的轉(zhuǎn)錄，其中Cdc25B mRNA探針雜交陽(yáng)性細(xì)胞在腸腺基底部和小腸絨毛中部分別占上皮細(xì)胞總數(shù)的81.60％±9.63％和36.21％±8.81％。原位雜交陽(yáng)性產(chǎn)物大部分分布于十二指腸腸腺上皮“干細(xì)胞部”和“增生部”細(xì)胞的胞質(zhì)和

6、胞核中，腸腺基底部由下至上，雜交信號(hào)逐漸減弱，至小腸絨毛下部消失，轉(zhuǎn)為陰性。在粘膜肌層以及肌肉層里雜交反應(yīng)呈陰性。本研究從基因水平證明了雞十二指腸粘膜腸腺上皮“干細(xì)胞部”和“增生部”細(xì)胞中有Cdc25B mRNA的存在，表明該區(qū)域有活躍的增殖過(guò)程，以補(bǔ)充絨毛上端死亡脫落的細(xì)胞。Cdc25B的表達(dá)趨勢(shì)與哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞增殖分區(qū)相一致，推測(cè)雞的腸腺和粘膜上皮也和哺乳動(dòng)物一樣分為腸腺基部的“潘氏細(xì)胞-干細(xì)胞部”和中部的“增生部”、腸腺上部“成