食品科學(xué)與工程畢業(yè)論文氨基葡萄糖反應(yīng)器的制備

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文</b></p><p><b>　?。?0 屆）</b></p><p>　　氨基葡萄糖反應(yīng)器的制備</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級(jí) 食品科學(xué)與工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號(hào) </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b></p>

3、<p><b>　　摘要.1</b></p><p>　　Abstract....................................................................................................................2</p><p><b>　　1

4、前言3</b></p><p>　　1.1 氨基葡萄糖簡(jiǎn)介3</p><p>　　1.1.1 氨基葡萄糖的應(yīng)用3</p><p>　　1.1.2 國內(nèi)外目前對(duì)氨基葡萄糖的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景3</p><p>　　1.1.3 微生物法（固定化酶）制備氨基葡萄糖的前景4</p><p>　　1.2 生

5、物反應(yīng)器的簡(jiǎn)介4</p><p>　　1.2.1 生物反應(yīng)器的現(xiàn)狀及發(fā)展4</p><p>　　1.2.2 轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器存在的弊端5</p><p>　　1.2.3 填充床反應(yīng)器簡(jiǎn)介及優(yōu)缺點(diǎn)5</p><p>　　1.3 本文研究?jī)?nèi)容5</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑5</p&g

6、t;<p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑5</p><p>　　2.2 主要儀器6</p><p><b>　　2.3 培養(yǎng)基6</b></p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法6</b></p><p>　　3.1 培養(yǎng)條件6</p><p>　　3.

7、2 殼聚糖酶液的制備6</p><p>　　3.3 外切殼聚糖酶的濾取6</p><p>　　3.4 固定化外切殼聚糖酶的制備6</p><p>　　3.5 固定化殼聚糖外切酶活力的測(cè)定7</p><p>　　3.6 氨基葡萄糖熒光光度分析法7</p><p>　　3.7 酶水解產(chǎn)物除蛋白質(zhì)7</p&

8、gt;<p>　　3.8 氨基葡萄糖反應(yīng)器的設(shè)計(jì)7</p><p>　　3.8.1 反應(yīng)器流程7</p><p>　　3.8.2 上流式填充床反應(yīng)器的設(shè)計(jì)8</p><p>　　3.9 反應(yīng)器的運(yùn)行9</p><p>　　3.10 反應(yīng)器生產(chǎn)強(qiáng)度、停留時(shí)間、產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的計(jì)算9</p><p>　

9、　4 設(shè)計(jì)結(jié)果與討論10</p><p>　　4.1 停留時(shí)間的影響10</p><p>　　4.1.1不同停留時(shí)間對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響10</p><p>　　4.1.2不同停留時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響10</p><p>　　4.2 底物濃度的影響11</p><p>　　4.2.2 不同底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響1

10、1</p><p>　　4.3 反應(yīng)器長期運(yùn)行情況的考察11</p><p>　　4.3.1 生產(chǎn)強(qiáng)度的考察11</p><p>　　4.3.2 轉(zhuǎn)化率的考察12</p><p><b>　　5 小結(jié)12</b></p><p><b>　　參考文獻(xiàn)13</b>&l

11、t;/p><p><b>　　致謝14</b></p><p>　　氨基葡萄糖反應(yīng)器的制備</p><p>　　[摘要] 氨基葡萄糖是一種葡萄糖的一個(gè)羥基被一個(gè)氨基取代的化合物。生物反應(yīng)器就是利用酶或生物體具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的系統(tǒng)裝置。</p><p>　　本文主要是設(shè)計(jì)生產(chǎn)氨基葡萄糖的反應(yīng)器（包括了進(jìn)樣系

12、統(tǒng)、回流系統(tǒng)、電路系統(tǒng)、填充床生物反應(yīng)器、恒溫水浴鍋、產(chǎn)物收集裝置）。研究了生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率的影響因素—不同停留時(shí)間和不同底物濃度以及考察了該反應(yīng)器長期運(yùn)行情況。結(jié)果表明：當(dāng)停留時(shí)間為20min時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率達(dá)到最佳數(shù)值，其最大值分別為45.37（g/l.h）、78.6%；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到350mg/m3時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率達(dá)最佳數(shù)值，為68.92（g/l.h）、69.0%。</p><p>　　[關(guān)鍵詞]

13、固定化；殼聚糖外切酶；填充床反應(yīng)器；氨基葡萄糖</p><p>　　Preparation of glucosamine reactor</p><p>　　[Abstract] Glucosamine is a compound which is an hydroxyl of glucose replaced by a amin. Bioreactor is a system which

14、 use the biological functions of enzymes or organisms (eg microbes) to Biochemically react in vitro. </p><p>　　This article is to design the reactor of production glucosamine(Including the sampling system, r

15、eturn system, electrical system, packed bed bioreactor, temperature water bath, the product collection device). Strength of the production and conversion factors-different residence time anddifferent substrate concentrat

16、ion And the effects of long-term operation of the reactor. The results showed that: when the residence time for the 20min, the intensity and the conversion rate of production to achiev</p><p>　　[Key words] I

17、mmobilized;Chitosan exonuclease;Packed bed reactor; Glucosamine</p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　1.1 氨基葡萄糖簡(jiǎn)介</p><p>　　氨基葡萄糖是一種葡萄糖的一個(gè)羥基被一個(gè)氨基取代的化合物。分子式C6H13O5N，俗稱氨基糖。廣泛存在于自然界

18、，2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通常以N-乙酰基衍生物（如甲殼素）或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚（胞壁酸）形式存在于微生物、動(dòng)物來源的多糖和結(jié)合多糖中。它是在人體內(nèi)合成的物質(zhì)，是形成軟骨細(xì)胞的重要營養(yǎng)素和保持關(guān)節(jié)軟骨健康的天然組織成份。隨著人類年齡的不斷增長，人體內(nèi)氨基葡萄糖越來越缺乏，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨不斷退化和磨損。美國、歐洲和日本的大量醫(yī)學(xué)研究表明：氨基葡萄糖可以幫助修復(fù)和維護(hù)軟骨，并刺激軟骨細(xì)胞的生長[1]。</p

19、><p>　　1.1.1 氨基葡萄糖的應(yīng)用</p><p>　　氨基葡萄糖有很多衍生物，包括N-乙酰氨基葡萄糖，N-乙酰氨基葡萄糖-l-磷酸鹽，氨基葡萄糖硫酸化、磺酸化與鹽酸化衍生物都具有非常重要的醫(yī)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[2]。另外，氨基葡萄糖與葡萄糖醛酸、半乳糖、硫酸葡萄糖醛酸等結(jié)合能夠形成透明質(zhì)酸、角質(zhì)硫酸、硫酸肝素等重要的機(jī)體活性物質(zhì)，參與機(jī)體保護(hù)，如肝腎解毒、抗炎、抗低氧作用，刺激嬰

20、兒腸道中雙歧桿菌增殖等[3]。氨基葡萄糖還可以改善微血管循環(huán)，促進(jìn)抗生素藥劑的注射，是生產(chǎn)抗癌藥氯脲霉素的主要原料。陳忻[4]在國內(nèi)首次報(bào)道了氨基葡萄糖的防腐抗菌作用。他的研究結(jié)果顯示氨基葡萄糖對(duì)食品中常見的21種細(xì)菌、霉菌、酵母菌均有明顯的抗菌作用，其中細(xì)菌最為敏感。在醫(yī)藥上，氨基葡萄糖可作為抗菌消炎藥物，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和胃潰瘍，同時(shí)也有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[5]。</p><p>　　氨基葡萄糖是一種

21、具有很多生理功能、重要醫(yī)藥價(jià)值的物質(zhì)，它的活性是由于其獨(dú)特的小分子結(jié)構(gòu)，極其活潑的功能團(tuán)，因此具有很強(qiáng)的滲透力和親合力，很容易透過人體的細(xì)胞膜，流通人體血管內(nèi)的積瘀，特別能促使毛細(xì)血管正常有序地工作，從而改善微循環(huán)并從根本上改善和恢復(fù)人體的生理機(jī)能，從而發(fā)揮其防病和輔助治病的保健功效。作為一種單糖衍生物，氨基葡萄糖與殼寡糖一樣在體內(nèi)具有易被吸收、轉(zhuǎn)化和利用等特點(diǎn)，且較殼寡糖能夠發(fā)揮更重要的生物學(xué)功能。</p><p&

22、gt;　　目前，越來越多的人開始研究氨基葡萄糖及其衍生物的加工工藝。</p><p>　　1.1.2 國內(nèi)外目前對(duì)氨基葡萄糖的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景</p><p>　　因氨基葡萄糖具有一些獨(dú)特的功能，其生產(chǎn)工藝也日益成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。目前“綠色化學(xué)”的生物制備法備受關(guān)注。比如，美國的Chmielowski和臺(tái)灣的合作者建立了以葡萄糖為原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖的方法，在這一過程中他們采用代

23、謝工程的手段，首先使E. coli在glmS所編碼的葡萄糖胺合成酶的作用下以谷氨酸為氨基供體將6-磷酸-果糖轉(zhuǎn)化成為6-磷酸-葡萄糖胺，該化合物在Saccharomyces cerevisiae N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的催化下生成N-乙酰葡萄糖胺，接著脫乙酰生成氨基葡萄糖。</p><p>　　現(xiàn)在氨基葡萄糖最熱門的制備方法都是利用酶這種生物催化劑來實(shí)現(xiàn)的，國內(nèi)外關(guān)于殼聚糖酶方面的研究頗多。國外己相繼從許多微生物中分離、

24、純化了具有種屬特異性的殼聚糖酶，他們對(duì)產(chǎn)殼聚糖酶的Bacillus屬和Streptomyces屬的菌株作了研究，包括酶的分離純化和基因克隆等分子水平研究。國內(nèi)關(guān)于殼聚糖酶的研究起步較晚，至1997年中科院大連物化所等研究機(jī)構(gòu)才開始關(guān)注殼聚糖酶[6]。近年來，國內(nèi)許多科研機(jī)構(gòu)相繼篩選到了產(chǎn)殼聚糖酶球孢白僵菌[7](中科院大連物化所)、青霉菌[8](浙江大學(xué))、假單孢菌 [9](鄭州糧食學(xué)院)和芽孢桿菌[10](上海農(nóng)科院植保所)，并對(duì)這些

25、微生物所產(chǎn)的殼聚糖酶進(jìn)行了分離純化。吳綿斌等還研究了采用螺旋床反應(yīng)器和三相流化床反應(yīng)器來生產(chǎn)殼聚糖酶[11]。側(cè)重點(diǎn)方面，國外側(cè)重研究不同來源的殼聚糖酶對(duì)不同底物的水解模式及其分子結(jié)構(gòu)的研究，然后與已知的殼聚糖酶核苷酸序列進(jìn)行比較并分析其同源性，為基礎(chǔ)生命科學(xué)研究提供信息。就目前情況來看，研究最深入的是放線菌屬Streptomyces N174，對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，活性中心基團(tuán)進(jìn)行了研究。</p><p>　　目前，關(guān)

26、于氨基葡萄糖的研究方法已經(jīng)不少，但是存在的問題是藥物釋放速度慢、產(chǎn)量低、成本高等。如何能都低成本、高產(chǎn)率、規(guī)模化生產(chǎn)氨基葡萄糖，并且制作成人體更易于吸收的藥劑，已經(jīng)是研究氨基葡萄糖的重中之重！</p><p>　　1.1.3 微生物法（固定化酶）制備氨基葡萄糖的前景</p><p>　　在日益重視環(huán)保節(jié)能的當(dāng)今社會(huì)，利用微生物法生產(chǎn)氨基葡萄糖是大勢(shì)所趨。因?yàn)橛梦⑸镏苽涞脑捈葷M足了現(xiàn)代社會(huì)

27、的需要，節(jié)能減排，成本低，污染小，又有望在氨基葡萄糖的生產(chǎn)方面形成大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，有著廣闊的產(chǎn)業(yè)化前景，為社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益。</p><p>　　1.2 生物反應(yīng)器的簡(jiǎn)介</p><p>　　生物反應(yīng)器，英文名：bioreactor。它是用于生物反應(yīng)過程的容器總稱。包括酶反應(yīng)器（游離酶和固定酶反應(yīng)器）、固定細(xì)胞反應(yīng)器、各種細(xì)胞培養(yǎng)器、發(fā)酵罐和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等?？捎糜谥苽浠蛏a(chǎn)某些生物反應(yīng)

28、產(chǎn)物，有的可作為生物傳感器。是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進(jìn)行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，它是一種生物功能模擬機(jī)，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細(xì)胞反應(yīng)器等。在酒類、醫(yī)藥生產(chǎn)、有機(jī)污染物降解方面有重要應(yīng)用。生物工程上的生物反應(yīng)器是在體外模擬生物體的功能，設(shè)計(jì)出來用于生產(chǎn)或檢測(cè)各種化學(xué)品的反應(yīng)裝置。</p><p>　　1.2.1 生物反應(yīng)器的現(xiàn)狀及發(fā)展</p><p>　　生物反

29、應(yīng)器（bioreactor）的發(fā)展有3個(gè)階段：細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器。自從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器[12]一出現(xiàn)就受到人們非常大的關(guān)注，因?yàn)樗朔饲皟蓚€(gè)階段的缺陷，諸如細(xì)胞基因工程產(chǎn)物很多時(shí)候不具備生物活性，得經(jīng)過糖基化等一系列修飾加工之后才可以成為有效的藥物，并且細(xì)胞基因工程因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)條件十分苛刻、成本又高從而限制了批量生產(chǎn)。但是，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器就具有產(chǎn)量高、易提純的優(yōu)點(diǎn)。一般把目的片段在器官

30、或組織中表達(dá)的動(dòng)物叫做動(dòng)物生物反應(yīng)器。但凡有生命的器官、組織都可以人為的轉(zhuǎn)變?yōu)樯锓磻?yīng)器。從生產(chǎn)的角度考慮的話，生物反應(yīng)器所選擇的組織或器官便于產(chǎn)物的獲得，例如乳腺、血液等，因此動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器、動(dòng)物血液生物反應(yīng)器和動(dòng)物膀胱生物反應(yīng)器等相繼出現(xiàn)并且發(fā)展。其中，最為引人注目的是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器的研究。</p><p>　　1.2.2 轉(zhuǎn)基因生物反應(yīng)器存在的弊端</p><p>　　

31、首先是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有很多問題需解決。例如，由于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基因是鑲嵌整合型的，因此二代不一定為轉(zhuǎn)基因型。但是觀察豬和山羊得出只要轉(zhuǎn)基因型從起始個(gè)體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。但是其他一些因素如外源基因整合率低，胚胎移植受孕率低等都令有效的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物大幅度減少。同時(shí)，由于目前對(duì)調(diào)控表達(dá)水平的程序，指導(dǎo)進(jìn)行精確的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達(dá)的程序，及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認(rèn)識(shí)尚不足夠，極易

32、引起異位點(diǎn)表達(dá)；現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點(diǎn)，因此存在了對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達(dá)會(huì)受整合的不同位點(diǎn)的影響[13]。這些因素使得先用小鼠對(duì)新基因構(gòu)型進(jìn)行常規(guī)試驗(yàn)在家畜長成前的前期階段。</p><p>　　盡管對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物反應(yīng)器的研究仍面臨著許多問題，但它潛在的社會(huì)價(jià)值無法估量。在未來幾年內(nèi)，即將有多種動(dòng)物乳腺生物反映器重組蛋白上市，從而形成具有廣闊市場(chǎng)前景和巨大利潤的新型生物制藥行業(yè)。

33、</p><p>　　1.2.3 填充床反應(yīng)器簡(jiǎn)介及優(yōu)缺點(diǎn)</p><p>　　填充床反應(yīng)器（Packed Bed Reactor，PBR），又稱為固定床反應(yīng)器。是將固定化酶填充于反應(yīng)器內(nèi)，制成穩(wěn)定的柱床，隨后，通入底物溶液，在較佳的反應(yīng)條件下實(shí)現(xiàn)酶催化反應(yīng)，并且要以一定的流速收集輸出的轉(zhuǎn)化液（含產(chǎn)物）。</p><p>　　優(yōu)點(diǎn)：操作容易、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、效率高等，從而

34、，PBR成為了目前工業(yè)生產(chǎn)及研究中應(yīng)用最普遍的反應(yīng)器。它適用于各種形狀的固定化酶和不含固體顆粒、黏度不大的底物溶液，以及有產(chǎn)物抑制效應(yīng)的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。</p><p>　　缺點(diǎn)：相對(duì)其他反應(yīng)器來說，傳質(zhì)系數(shù)和傳熱系數(shù)較低。當(dāng)?shù)孜锶芏群腆w顆粒或黏度很大時(shí)，PBR就不適用了。</p><p>　　1.3 本文研究?jī)?nèi)容</p><p>　　研究的主要內(nèi)容是先通過培養(yǎng)曲霉CJ

35、22-3菌[14]獲得殼聚糖酶，再篩選出殼聚糖酶的外切酶（生物催化劑）。通過酶的固定化技術(shù)將殼聚糖外切酶進(jìn)行固定，從而獲得固定殼聚糖外切酶，并將其應(yīng)用到本文設(shè)計(jì)的上流式填充床反應(yīng)器中與含殼聚糖的底物溶液充分反應(yīng)，最終獲得氨基葡萄糖。</p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器與試劑</p><p>　　2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑</p><p>　　曲霉CJ22-3菌株

36、，浙江海洋學(xué)院食品科學(xué)與工程實(shí)驗(yàn)室提供；殼聚糖（脫乙酰度89%，平均分子重量：685000）。</p><p>　　蝦殼粉（制作方法：把鮮蝦洗凈，脫水后放到冰箱里冷藏（注意不是冷凍），溫度保持在5℃以下。過5 min以后把蝦拿出來。皮就變得很容易脫下。將蝦殼用微火焙干，用酒瓶將焙干的蝦殼壓成小碎塊，再用食品粉碎機(jī)將其打成粉末，用不透氣的瓶子裝好可長期保持蝦殼粉香）。</p><p><

37、;b>　　2.2 主要儀器</b></p><p>　　儀器名稱 型號(hào) 生產(chǎn)廠家</p><p>　　電子分析天平 FA2004 上海精密儀器儀表有限公司</p><p>　　回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 DKY-1 上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公

38、司</p><p>　　生化培養(yǎng)箱 250B 常州國華電器有限公司</p><p>　　高速離心機(jī) X-22 Centrifuge 美國Beckman Coulter</p><p>　　紫外可見721分光光度計(jì) UV-754 上海分析儀器廠</p><p&g

39、t;<b>　　2.3 培養(yǎng)基</b></p><p>　?。?）斜面培養(yǎng)基（%）：膠狀殼聚糖 1，酵母膏 0.1，硫酸鋅 0.2，磷酸二氫鉀 0.2，硫酸鎂 0.05。調(diào)節(jié)pH至5.5。</p><p>　?。?）種子培養(yǎng)基（%）：膠狀殼聚糖 0.2，葡萄糖 1，麩皮 1，硫酸鐵 0.2，磷酸二氫鉀 0.2，硫酸鎂 0.05，自然pH。</p><

40、;p>　?。?）產(chǎn)酶培養(yǎng)基（%）：膠狀殼聚糖 1.5，硫酸鋅 0.2，磷酸二氫鉀 0.2，硫酸鎂 0.05，麩皮 1，pH 5.5。</p><p><b>　　3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p><b>　　3.1 培養(yǎng)條件</b></p><p>　　種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)好的斜面中挑取一環(huán)接入裝有40 mL種子培養(yǎng)

41、基的容量為250 mL三角瓶中，在32℃、160 r/min的條件下培養(yǎng)24 h。</p><p>　　產(chǎn)酶培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液，以3 %(V/V)的接種量接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在32℃、160 r/min的搖床上培養(yǎng)48 h。</p><p>　　3.2 殼聚糖酶液的制備</p><p>　　將發(fā)酵液4 ℃ 下，5000 r/min，冷凍離心15 min，得到粗酶

42、液，緩緩加入硫酸銨至飽和度80%，加完后繼續(xù)攪拌1 h，沉降過夜，以上操作均在冰上進(jìn)行。12000 r/min，4 ℃ ，離心20 min，沉淀以50 mM 醋酸鹽緩沖液（pH 6.0）溶解，使用同樣緩沖液用Sephadex G-25脫鹽柱進(jìn)行脫鹽處理，然后上CM-sephadex柱進(jìn)一步分離純化，收集酶活管即為殼聚糖酶液。</p><p>　　3.3 外切殼聚糖酶的濾取</p><p>

43、　　由于曲霉發(fā)酵液中內(nèi)切殼聚糖酶和外切殼聚糖酶的相對(duì)分子質(zhì)量差別很大，前者為29Da左右，后者為100kDa左右[19]，所以可采用超濾法對(duì)外切殼聚糖酶進(jìn)行分離。外切殼聚糖酶分子量較大，不能通過分子量截留值為50000的膜；而內(nèi)切殼聚糖酶和發(fā)酵液中一些小分子物質(zhì)分子量較小，則可通過分子量截留值為50000的膜。因此，發(fā)酵液經(jīng)分子量截留值為50000的膜過濾后，截留物即為所需外切殼聚糖酶。</p><p>　　3.

44、4 固定化外切殼聚糖酶的制備</p><p>　　取上述殼聚糖酶B溶液0.5ml，加入到12 ml 2.5 %(T控制在50 ℃以下)海藻酸鈉溶液中，攪拌25-30 min，乳化10分鐘左右，用8號(hào)注射器將上述混合液以6cm高度注入4 % CaCl2溶液中立即形成光滑的微球體，并將此固定化[21,22,23]小球保持在4 ℃的上述氯化鈣液中靜置4 h，得到直徑約2 mm的顆粒，用生理鹽水洗滌2次后將固定化外切殼聚

45、糖酶貯存在3℃的冰箱中備用。</p><p>　　3.5 固定化殼聚糖外切酶活力的測(cè)定</p><p>　　離心發(fā)酵液，10000×g離心10 min，取上清液0.5 mL，加入1 mL 0.5 %（m/v）的殼聚糖溶液（pH 5.0，脫乙酰度83 %）和0.2 mol/L的HAc-NaAc緩沖液（pH 5.0）3.5 mL。在40 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15 min，立即加入2 m

46、L DNS試劑，混勻，置沸水浴中反應(yīng)6min，冷卻后定容至25 mL，離心去除未水解的殼聚糖，取上清液測(cè)OD510值。等量煮沸滅活的發(fā)酵液作為空白對(duì)照。殼聚糖酶酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘水解底物形成相當(dāng)于1 μmol 氨基葡萄糖時(shí)所用酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。</p><p>　　3.6 氨基葡萄糖熒光光度分析法</p><p>　　由于氨基葡萄糖與吡哆醛縮合反應(yīng)形成的Schi

47、ff堿，能與Zn2+通過氫鍵結(jié)合生成在特定波長激發(fā)下具有熒光吸收的Schiff 堿金屬配合物，在較稀的溶液中，其濃度與熒光強(qiáng)度在一定的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，從而建立測(cè)定氨基葡萄糖的熒光光度法[19,20]。熒光激發(fā)波長為386 nm，發(fā)射波長為475 nm，靈敏度1，狹縫寬10 nm，線性范圍為15 mg/L～65 mg/L，擬合優(yōu)度98.549 %。</p><p>　　3.7 酶水解產(chǎn)物除蛋白質(zhì)</p>

48、;<p>　　酶水解產(chǎn)物溶液中加入少量的10%三氯乙酸，溶液調(diào)pH值4.5~ 5.0，4℃下放置過夜，沉淀酶蛋白，以5800 r/ min離心35min，取其上清液，濾紙抽濾，用乙醇沉淀，真空干燥， 得到較純的氨基葡萄糖。</p><p>　　3.8 氨基葡萄糖反應(yīng)器的設(shè)計(jì)</p><p>　　3.8.1 反應(yīng)器流程</p><p>　　本設(shè)計(jì)包括了進(jìn)

49、樣系統(tǒng)、回流系統(tǒng)、電路系統(tǒng)、填充床生物反應(yīng)器、恒溫水浴鍋、產(chǎn)物收集裝置6個(gè)主要部分，流程如圖1所示。</p><p>　　圖1 氨基葡萄糖反應(yīng)器設(shè)計(jì)圖</p><p>　　進(jìn)樣系統(tǒng)：所用反應(yīng)底物流為含殼聚糖4%的LHAC-NaAC緩沖液（pH5.6）。將底物溶液裝到如圖1中編號(hào)為1的儲(chǔ)液罐中，儲(chǔ)液罐置于恒溫水浴裝置中以維持反應(yīng)條件恒定。用恒流泵將底物溶液從底部注入到反應(yīng)器中，溶液自下而上流

50、經(jīng)填料層，被固定化外切殼聚糖酶降解。</p><p>　　回流系統(tǒng)：本實(shí)驗(yàn)為減輕填料層的負(fù)荷，提高整個(gè)反應(yīng)器的性能，也為防止流速慢導(dǎo)致的填料層堵塞，設(shè)計(jì)了回流系統(tǒng)。分析出口產(chǎn)物的氨基葡萄糖含量，如果含量比較低則可以開啟回流裝置，通過恒流泵把產(chǎn)物回流到進(jìn)樣系統(tǒng)中再次反應(yīng)，這樣也能減少填料層底部所受的負(fù)荷。 </p><p>　　電路系統(tǒng)：所有的用電設(shè)備均由電控柜控制。</p>

51、<p>　　上流式固定填充床反應(yīng)器：具體參照方法3.8.2。</p><p>　　恒溫水浴鍋：酶活性對(duì)環(huán)境溫度較敏感，溫度偏高或偏低都不利于酶活性的保持，本實(shí)驗(yàn)中將表現(xiàn)為反應(yīng)速度慢及轉(zhuǎn)化率低。因此，為取得較好的實(shí)驗(yàn)效果，需要通過溫度控制系統(tǒng)保證適宜的、基本恒定的環(huán)境溫度。通過水浴鍋裝置穩(wěn)定底物溶液及反應(yīng)體系的溫度。</p><p>　　產(chǎn)物收集裝置：該裝置顧名思義，即為收集產(chǎn)物的

52、容器。</p><p>　　3.8.2 上流式填充床反應(yīng)器的設(shè)計(jì)</p><p>　　上流式填充床反應(yīng)器的設(shè)計(jì)對(duì)整個(gè)裝置的正常運(yùn)行和具體操作至關(guān)重要。需要考慮到反應(yīng)器的密閉性、取樣的可操作性和各參數(shù)的易控制性。</p><p>　　圖2 反應(yīng)器主體部分參數(shù)（單位mm）</p><p>　　反應(yīng)器主體部分：是用有機(jī)玻璃制成的，內(nèi)徑100mm，高

53、800mm，內(nèi)裝固定化外切殼聚糖酶，填充層高500mm，水浴鍋?zhàn)⑺睆?0mm，從填料層同樣高度注入，出水口高度為770mm，填充層直徑為60mm，填料層用有機(jī)玻璃板支撐，板上打孔，使得底物溶液可以通過。為防止固定化外切殼聚糖酶將孔堵塞，在支撐板上專門設(shè)計(jì)擱條，其間距小于固定化外切酶的直徑。</p><p>　　溫控系統(tǒng)：采用控制反應(yīng)器夾套循環(huán)水溫度的方式控制反應(yīng)體系的溫度，分別利用恒溫水浴鍋和恒流泵控制循環(huán)水的

54、溫度和流速。</p><p>　　反應(yīng)系統(tǒng)：包括底物的注入和產(chǎn)物的輸出。為了控制底物注入的流速，在這里可以用恒流泵調(diào)節(jié)，因?yàn)槿绻魉龠^快的話，底物和酶還沒有充分的接觸或者沒有獲得良好的反應(yīng)時(shí)間。如果流速過慢的話可能會(huì)形成酶的阻塞也不利于反應(yīng)的進(jìn)行。</p><p>　　密封性能：因?yàn)樵摲磻?yīng)是殼聚糖單一性酶（固定外切殼聚糖酶），如果密閉不好的話，會(huì)導(dǎo)致雜菌污染。這樣的話，得到的產(chǎn)物就是氨基葡

55、萄糖和其他物質(zhì)的混合物。氨基葡萄糖的產(chǎn)率也會(huì)降低。</p><p>　　電路系統(tǒng)：反應(yīng)所需的供電設(shè)備主要是兩個(gè)恒流泵，由于涉及到水流和用電，為保證安全操作和方便操作，設(shè)計(jì)電路控制系統(tǒng)，并由電控柜控制整個(gè)系統(tǒng)的電路。</p><p>　　其它附件：整個(gè)系統(tǒng)的水路和氣路均由管路連接。恒流泵、電控柜和上流固體填充床固定在一個(gè)特定的角鐵架子上，既便于操作又整齊美觀。</p><

56、p>　　3.9 反應(yīng)器的運(yùn)行</p><p>　　稱取20g殼聚糖固定化外切酶(85.3 U/g)置于填充床反應(yīng)器中，底物殼聚糖溶液以10 mL/h的流速從反應(yīng)器底部連續(xù)進(jìn)入，并定時(shí)取樣測(cè)定。</p><p>　　3.10 反應(yīng)器生產(chǎn)強(qiáng)度、停留時(shí)間、產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率的計(jì)算</p><p>　　生產(chǎn)強(qiáng)度( Qp) = P·q/ VR；轉(zhuǎn)化率(Yp/s) =(

57、S0 -St) / S0；停留時(shí)間(t) = VR/q，其中， P ：流出液中的產(chǎn)物濃度(g/L)，q：流速(L/h)，VR :反應(yīng)器的體積(L)，S0 :流入反應(yīng)器的底物濃度(g/L)，St :流出反應(yīng)器的底物終濃度(g/L)。</p><p><b>　　4 設(shè)計(jì)結(jié)果與討論</b></p><p>　　4.1 停留時(shí)間的影響</p><p>

58、;　　4.1.1不同停留時(shí)間對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響</p><p>　　不同停留時(shí)間對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響不同，如圖3所示，8min時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度為12.36(g/l.h)，一直到20min時(shí)達(dá)到最大生產(chǎn)強(qiáng)度45.37(g/l.h)，隨后開始下降。</p><p>　　圖3.停留時(shí)間對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響</p><p>　　4.1.2不同停留時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響</p>&

59、lt;p>　　停留時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果如圖4所示，停留時(shí)間為5-15min這一區(qū)間轉(zhuǎn)化率隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并且在15min達(dá)到最大（轉(zhuǎn)化率為78.6%），從15-30min轉(zhuǎn)化率基本保持不變。</p><p>　　圖4.停留時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響</p><p>　　4.2 底物濃度的影響4.2.1 不同底物濃度對(duì)對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響</p><p>　

60、　本次實(shí)驗(yàn)采用的底物濃度為100-400mg/m3,如圖5所示，當(dāng)?shù)孜餄舛葟?00-250 mg/m3變化時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度上升趨勢(shì)快，之后上升趨勢(shì)較緩，底物濃度為400 mg/m3時(shí)，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大值68.92(g/l.h).</p><p>　　圖5.底物濃度對(duì)生產(chǎn)強(qiáng)度的影響</p><p>　　4.2.2 不同底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響</p><p>　　底物濃度對(duì)

61、轉(zhuǎn)化率的影響如圖6結(jié)果示，轉(zhuǎn)化率在底物濃度為100mg/m3時(shí)為最大79.0%,隨著底物濃度的不斷增加，轉(zhuǎn)化率逐漸降低。</p><p>　　圖6.底物濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響</p><p>　　4.3 反應(yīng)器長期運(yùn)行情況的考察</p><p>　　4.3.1 生產(chǎn)強(qiáng)度的考察</p><p>　　圖7為可轉(zhuǎn)化殼聚糖生產(chǎn)氨基葡萄糖的上流式填充床反應(yīng)

62、器長期運(yùn)行時(shí)的生產(chǎn)強(qiáng)度考察情況。當(dāng)連續(xù)反應(yīng)至第2天時(shí)，填充床反應(yīng)器的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大值0.092g/(L·h) ;隨后固定化酶的酶活力隨著時(shí)間的延長而逐步下降，生產(chǎn)強(qiáng)度也逐漸降低，第10天的生產(chǎn)強(qiáng)度已降至0.04 g/(L·h)以下。</p><p>　　圖7 反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行中生產(chǎn)強(qiáng)度的考察</p><p>　　4.3.2 轉(zhuǎn)化率的考察</p><p

63、>　　圖8為上流式填充床反應(yīng)器長期運(yùn)行時(shí)的氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化率考察情況。在第1天到第4天期間，填充床反應(yīng)器的氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化率均能達(dá)到78.51%～79.67%;之后由于固定化酶的酶活力隨著時(shí)間的延長而逐步下降，轉(zhuǎn)化率也隨之降低，但10天之內(nèi)轉(zhuǎn)化率均能保持在55%以上。上述結(jié)果表明該反應(yīng)器的操作效果良好。</p><p>　　圖8反應(yīng)器連續(xù)運(yùn)行中氨基葡萄糖轉(zhuǎn)化率的考察</p><p>&l

64、t;b>　　5 小結(jié)</b></p><p>　?。?）通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析殼聚糖外切酶最佳反應(yīng)pH4.0-6.0，最佳反應(yīng)溫度為30-70 ℃。同時(shí)也確定了固定化外切殼聚糖酶的固定條件：海藻酸鈉濃度2.5%，CaCl2濃度4.0%，固定化時(shí)間4h，固定化酶直徑2mm，這樣的話可以使酶保持比較好的活性。</p><p>　?。?）氨基葡萄糖反應(yīng)器的生產(chǎn)強(qiáng)度隨時(shí)間的變化先上升后

65、下降，在第二天時(shí)達(dá)到最大，之后會(huì)隨著酶活性的降低而降低；產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率是前四天先保持基本不變，隨后也會(huì)隨著酶活性的降低而降低。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] Reginster JY,Deroisy R.Long-term effects of glucosamine sulphate on osteo-arthritis pr

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