鐵離子對微生物生長的影響及螯合劑抑菌機理研究【畢業(yè)設(shè)計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設(shè)計</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　鐵離子對微生物生長的影響及螯合劑抑菌機理研究</p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 食品質(zhì)量與安全 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目錄</b&g

3、t;</p><p><b>　　1 引言2</b></p><p><b>　　2材料與方法3</b></p><p>　　1.1 試驗材料與設(shè)備3</p><p>　　2.1.1 菌株3</p><p>　　2.1.2 主要試劑3</p><

4、p>　　2.1.3 培養(yǎng)基3</p><p>　　2.1.4 主要設(shè)備3</p><p>　　2.2 試驗方法4</p><p>　　2.2.1 菌種保藏與活化4</p><p>　　2.2.2鐵含量測定4</p><p>　　2.2.3 鐵依賴實驗5</p><p>　　2.

5、2.4 螯合劑的抑菌作用5</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論6</b></p><p>　　3.1 培養(yǎng)基中的鐵含量測定結(jié)果6</p><p>　　3.2 四種菌的適宜鐵濃度7</p><p>　　3.2.1 適宜鐵濃度分析7</p><p>　　3.2.2 加入鐵離子價態(tài)選擇

6、說明8</p><p>　　3.3 培養(yǎng)基的選擇8</p><p>　　3.4 螯合劑的抑制效果9</p><p>　　3.4.1 細胞結(jié)構(gòu)對抗菌效果的影響11</p><p>　　3.4.2 蠟樣芽孢菌抗性對抗菌效果的影響12</p><p>　　3.4.3 細菌適宜生長鐵濃度對抗菌效果的影響12<

7、/p><p><b>　　4 結(jié)論13</b></p><p>　　致謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻13</b></p><p>　　摘 要：本文通過研究鐵對微生物生長的影響，從而進一步研究鐵螯合劑的抑菌效果及抑菌機理。根據(jù)所測定的腦心浸液培養(yǎng)基及普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中鐵

8、的含量，在基本培養(yǎng)中加入不同濃度的鐵離子，通過微生物的長勢得出大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌和銅綠假單胞菌四種細菌的適宜鐵生長濃度分別為40、60、20、40 mg/L。此外，測定了DTPA等五種不同鐵螯合劑對這四種細菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這五種鐵螯合劑對四種菌有不同程度的抑制，但不能完全抑制，且對陽性菌的抑制效果好于陰性菌。</p><p>　　關(guān)鍵詞：細菌；抗菌；鐵；螯合劑</p>&l

9、t;p>　　Abstract：The impact of iron on microbial growth was studied, then the antibacterial activity of iron chelators and inhibition mechanism were further studied. The optimum growth concentration of iron of Escherich

10、ia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus and Pseudomonas aeruginosa were 40, 60, 20, 60mg/L respectively by adding different concentrations of iron into basic culture medium, According to the measured brain heart

11、infusion agar media and the general nutrition content of iron. In add</p><p>　　Keywords: Bacteria; antibiosis; iron; chelating agent</p><p><b>　　1 引言</b></p><p>　　由細菌、病毒

12、和霉菌等導(dǎo)致的微生物危害，使人們長期以來采用各種方法與各類微生物的危害進行斗爭，抗菌一直是人類所關(guān)注的課題。近些年來，接連發(fā)生“非典”、“禽流感”、“甲流”等各種致病性微生物對人類社會的危害事件，細菌性食物中毒事件也時有發(fā)生，越來越引起人們對抗菌課題的關(guān)注。而當(dāng)這些有害菌對傳統(tǒng)的抗菌劑產(chǎn)生抗藥性時，尋找新的安全有效的抗菌劑已成為亟需解決的重要課題。</p><p>　　抗菌劑的研究始于20世紀(jì)80年代初。近年來，

13、隨著合成技術(shù)的發(fā)展，人們開發(fā)了許多抗菌劑，在醫(yī)藥、食品中得到了廣泛的應(yīng)用。目前，已研制及應(yīng)用的抗菌劑可歸為：天然抗菌劑、有機抗菌劑及無機抗菌劑。</p><p>　　天然抗菌劑是人類最早使用的抗菌劑，它是從某些動植物體內(nèi)提取出的具有抗菌活性的高分子有機物。最常用的天然抗菌劑是殼聚糖及其衍生物，它是一種抗菌譜較廣的天然物質(zhì)，對細菌、酵母菌、真菌等微生物均有不同程度的抑制作用[1]。殼聚糖具有質(zhì)子化銨，質(zhì)子化銨又帶有

14、正電荷，因此能與細菌帶負電荷的細胞膜作用，干擾細菌細胞膜功能，造成細菌體內(nèi)細胞質(zhì)流失，從而抑制細菌生長。分子量小的殼聚糖還可以通過直接進入細菌體內(nèi)，干擾細菌的正常生理代謝，使之由內(nèi)部瓦解衰亡。</p><p>　　有機抗菌劑是通過化學(xué)反應(yīng)破壞細胞膜，使蛋白質(zhì)變性、代謝受阻，從而起到殺菌、防腐及防霉等作用。其作用速度快，可操作性好，穩(wěn)定性強，對微生物的抑制作用具有一定的特異性。季銨鹽類是目前國際上使用最廣泛的有機抗

15、菌劑，早在1995年Kourai H[2]等人就發(fā)表了關(guān)于含有不飽和烷基的季銨鹽抗菌劑具有高效、廣譜抗菌活性的報道。</p><p>　　無機抗菌劑是通過將無機抗菌成分與載體結(jié)合而制成，其中，載銀抗菌劑抗菌能力最強，故已商品化的抗菌劑多是銀系抗菌劑。根據(jù)殺菌機理的不同，又可以分為溶出型和光催化型兩種。溶出型無機抗菌劑的主要品種包括以沸石、活性炭、羥基磷灰石等為載體的銀、銅、鋅等金屬離子無機抗菌劑。光催化型無機抗菌

16、劑的價格極為低廉，且無毒，主要品種有鈦型TiO2、ZnO、SiO2等。</p><p>　　鐵是微生物生長的必需元素之一。它是電子傳遞鏈中鐵硫蛋白的氧化還原中心，參與核苷酸前體的還原反應(yīng)，是必不可少的營養(yǎng)因子。一切生物有機體從細菌到人類，其生存都需要有鐵的參與。鐵是地殼中含量居于第四位的元素，雖然含量豐富，但大多數(shù)生物機體卻不能得到充分供給，因為Fe3+在pH7的條件下溶解度很小，F(xiàn)e3+的濃度不超過10-18M

17、，而微生物生長的最低濃度約為10-7 -10-5M。</p><p>　　嗜鐵素是指一類由微生物在低鐵條件下合成的小分子量的，能特異地螯合Fe3+的一種螯合因子。它們的合成受鐵濃度的調(diào)節(jié)，它們被分泌到微生物的細胞外或細胞表面作為螯合因子來獲取Fe3+或者將鐵變?yōu)榭扇苄问揭员阄⑸锢?。它與Fe3+的結(jié)合能力非常強，并且有特異性，可以從各種水溶性和非水溶性的化合物中奪走Fe3+。嗜鐵素通常是在好氧和兼性厭氧微生物中

18、產(chǎn)生，還沒有發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)格厭氧、乳酸桿菌和高等生物中產(chǎn)生[3]。嗜鐵素先與寄主的鐵結(jié)合形成鐵-嗜鐵素復(fù)合物，這種復(fù)合物與細菌外膜上存在的一種特殊受體專門結(jié)合，然后將鐵釋放到菌體內(nèi)，提供細菌生長繁殖所需要的鐵，從而使加重感染或擴散。同時，嗜鐵素還可催化生成OH，進一步加重組織損傷，對細菌的生長繁殖實際上起到了輔助作用[4]。大多數(shù)微生物如大腸桿菌、克雷白桿菌、沙門氏菌及假單胞菌等都是通過釋放鐵螯合物與宿主的鐵結(jié)合蛋白競爭而獲得鐵[5]。<

19、;/p><p>　　有些細菌如鏈球菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎雙球菌、溶血性巴斯德氏菌和肺炎支原桿菌不能合成嗜鐵素，但它們的菌體膜上表達乳鐵蛋白受體，這樣也可以直接地和宿主乳鐵蛋白結(jié)合，從而由宿主含鐵蛋白上獲取鐵[6]。有些微生物還可以通過合成蛋白水解酶釋放到周圍環(huán)境中，去降解宿主鐵結(jié)合蛋白，從中獲取所需要的鐵[7]。</p><p>　　螯合劑在食品和化妝品中具有抑菌作用是近些年才發(fā)現(xiàn)的。Tom

20、等人用多種螯合劑對細菌和酵母菌進行抗菌實驗發(fā)現(xiàn)，EHPG能一直十種不同的葡萄球菌，而DTPA效果較差[8]。食品中常用的螯合劑有檸檬酸鹽、乳酸鹽、焦磷酸鹽和EDTA等[9]。鐵螯合劑就是其中比較重要的一種，鐵螯合劑能夠與鐵離子形成螯合物，因而降低環(huán)境中游離鐵的濃度，從而達到抑制細菌生長的作用。Leen[10]等人于93年就發(fā)現(xiàn)具有螯合三價鐵功能的HMP能有效抑制大腸桿菌和李斯特氏菌的生長?；阼F螯合劑有效的抗菌作用，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域得

21、到了廣泛的應(yīng)用。例如已經(jīng)商品化的二乙烯三胺五乙酸（Dietlylene triamine-penta acetic acid, DTPA）作為一種鐵離子螯合劑成功地應(yīng)用到醫(yī)療領(lǐng)域。</p><p>　　因此，本文研究了鐵對微生物生長的影響，并且對幾種抗菌劑的抗菌效果及機理進行研究和探討。</p><p><b>　　2材料與方法</b></p><

22、p>　　1.1 試驗材料與設(shè)備</p><p><b>　　2.1.1 菌株</b></p><p>　　大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)由實驗室分離得到。</p>

23、<p>　　2.1.2 主要試劑</p><p>　　鄰菲羅啉、鹽酸羥胺、硫酸亞鐵胺、硫酸、鹽酸、醋酸鈉</p><p><b>　　2.1.3 培養(yǎng)基</b></p><p>　　腦心浸液培養(yǎng)基（BHI） 蘇州興化市聯(lián)發(fā)化工試劑有限公司</p><p>　　腦心浸液瓊脂培

24、養(yǎng)基（BHI） 蘇州興化市聯(lián)發(fā)化工試劑有限公司</p><p>　　基本培養(yǎng)基(g/L)：磷酸氫二鉀 6g；磷酸二氫鉀 3g；硫酸銨 1g；琥珀酸 4g；水 1000ml。調(diào)節(jié)PH至7左右，滅菌后加入1.0ml 1M硫酸鎂，1.0ml 45mM 氯化鈣。</p><p>　　2.1.4 主要設(shè)備</p><p>　　. 快速蒸汽滅菌

25、鍋 天津超拓制造</p><p>　　生化培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司</p><p>　　無菌操作臺 上海精宏實驗設(shè)備有限公司</p><p>　　新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱

26、 寧波江南儀器廠</p><p>　　密封式恒溫可調(diào)電爐 嘉興市欣欣儀器設(shè)備有限公司</p><p>　　Cary 100 紫外/可見光分光光度計 美國瓦里安公司</p><p>　　電子天平 余姚市金諾天平儀器有限公司

27、</p><p>　　AB204-S電子天平 上海臺衡儀器儀表有限公司 </p><p><b>　　2.2 試驗方法</b></p><p>　　2.2.1 菌種保藏與活化</p><p>　　普通營養(yǎng)瓊脂斜面挑取一環(huán)至5mlBHI培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)24小時活化。菌種短

28、期保藏可采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面劃線，37℃下培養(yǎng)24小時后置于冰箱中冷藏保存；菌種長期保藏可采用普通營養(yǎng)瓊脂斜面環(huán)線，37℃下培養(yǎng)24小時后，加入滅菌后的石蠟油至超過培養(yǎng)基1cm，置于冰箱中冷藏保存。</p><p>　　2.2.2鐵含量測定</p><p>　　2.2.2.1 試劑配制</p><p>　　? 0.12%的鄰菲羅啉水溶液</p><

29、;p>　　稱取0.12g鄰菲羅啉置于燒杯中，加入60ml水，加熱至80℃左右使之溶解，移入100ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻備用。</p><p>　　? 10％鹽酸羥胺溶液</p><p>　　稱取10g鹽酸羥胺(NH2OH?HCl)，溶于純水中，并稀釋至100ml。</p><p><b>　　? 鐵標(biāo)準(zhǔn)貯備液</b></p

30、><p>　　準(zhǔn)確稱取0.7020 g硫酸亞鐵胺[(NH4)Fe(SO4)·6H2O]，溶于1:1硫酸50 mL中，轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，加水至標(biāo)線，搖勻。該溶液為每毫升含鐵100µg。使用時用水配制成每毫升相當(dāng)于2µg鐵。</p><p>　　? 50%醋酸鈉溶液</p><p><b>　　? 鹽酸</b&

31、gt;</p><p>　　2.2.2.2 樣品消化</p><p>　　稱取腦心浸液培養(yǎng)基與營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基各10.0g，置于瓷坩堝中，在小火上炭化后，移入550℃高溫爐中灰化成白色灰燼，取出，加入2ml1:1鹽酸，在水浴上蒸干，再加5ml水，加熱煮沸后移入100ml容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。</p><p>　　2.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制</p>

32、;<p>　　準(zhǔn)確吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml每毫升相當(dāng)于2µg鐵的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移入50ml容量瓶中，各加入5ml水后，加入1ml1:9鹽酸溶液、1ml10％鹽酸羥胺溶液及1ml0.12%的鄰菲羅啉溶液，用50%醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)至PH3~5，混勻后用水稀釋至50ml，搖勻后置于分光光度計510nm波長進行比色測定。</p><p>　　2.2.2.4樣品測定<

33、;/p><p>　　準(zhǔn)確吸取樣品溶液5ml（由于BHI中鐵含量較高，事先稀釋一倍），移入50ml容量瓶中，各加入5ml水后，加入1ml1:9鹽酸溶液、1ml10％鹽酸羥胺溶液及1ml0.12%的鄰菲羅啉溶液，用50%醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)至PH3~5，混勻后用水稀釋至50ml搖勻后置于分光光度計510nm波長進行比色測定，以空白為參比，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出鐵含量。</p><p>　　2.2.3 鐵依賴

34、實驗</p><p>　　2.2.3.1試劑的配制</p><p>　　? 不同含鐵量培養(yǎng)基系列一的配制</p><p>　　準(zhǔn)確稱取硫酸亞鐵10g，溶解于1L超純水中，分別吸取0.0、2.0、4.0、6.0、8.0ml至1L為滅菌的基本培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)PH至7左右，滅菌后加入1.0ml 1M硫酸鎂，1.0ml 45mM 氯化鈣。</p><p&

35、gt;　　? 不同含鐵量培養(yǎng)基系列二的配制</p><p>　　準(zhǔn)確稱取11.050g、22.099g、33.149g、44.199g腦心浸液培養(yǎng)基至1L未滅菌的基本培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)PH至7左右，滅菌后加入1.0ml 1M硫酸鎂，1.0ml 45mM 氯化鈣。配成鐵含量為20、40、60、80mg/l的培養(yǎng)基。</p><p>　　2.2.3.2 菌懸液制備及鐵作用</p>

36、<p>　　斜面挑取一環(huán)到5ml腦心浸液培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24小時。</p><p>　　用移液器吸取50μL菌懸液至5ml不同鐵含量的培養(yǎng)基系列一、系列二中，37℃培養(yǎng)24小時。</p><p>　　2.2.3.3 菌體計數(shù)</p><p>　　菌體濃度采用比色法測定600nm光密度（OD600），每個OD相當(dāng)于細胞干重0.359g/l。同時取三個連續(xù)

37、的合適的稀釋度，吸取50μL稀釋液加到培養(yǎng)皿中，倒上培養(yǎng)基。并做兩個平行。等待培養(yǎng)基干后倒置放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，第二天平板計數(shù)。</p><p>　　2.2.4 螯合劑的抑菌作用</p><p>　　2.2.4.1 菌懸液的準(zhǔn)備</p><p>　　斜面菌種挑取一環(huán)接種到腦心浸液瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)24小時。然后再挑取一環(huán)接種到5mL的腦心浸液培養(yǎng)基上，37

38、℃再培養(yǎng)24小時。接著，用移液器吸取50μL轉(zhuǎn)移一支新的腦心浸液培養(yǎng)基上，放到37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到其終濃度達到106 cfu/mL，大約需要18~ 20小時。</p><p>　　2.2.4.2 螯合作用</p><p>　　所有的試樣將在15×75mm的試管中進行，培養(yǎng)基為腦心浸液培養(yǎng)基，所有的試管中包含80μL抗菌劑和20μL菌懸液。對照管中只包含20μL菌懸液和80μ

39、L無菌水。37℃，作用2小時。</p><p>　　2.2.4.3 稀釋培養(yǎng)與統(tǒng)計</p><p>　　取三個連續(xù)的合適的稀釋度，吸取50μL稀釋液加到培養(yǎng)皿中，倒上培養(yǎng)基。并做兩個平行。等待培養(yǎng)基干后倒置放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，第二天平板計數(shù)。</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　

40、3.1 培養(yǎng)基中的鐵含量測定結(jié)果</p><p>　　目前溶液中鐵離子的測定方法有原子吸收法，極譜法，重鉻酸鉀法，容量法，分光光度法等。其中分光光度法測定鐵的方法較多，有的用雙波長法測定溶液中鐵離子及其它離子含量，有的選用不同顯色劑測定鐵離子含量如硫氫酸鉀-結(jié)晶紫、鄰二氮菲等[11]。</p><p>　　本文選用顯色劑鄰二氮菲的分光光度法測定腦心浸液培養(yǎng)基及普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中鐵的含量。

41、鄰二氮菲又稱鄰菲啰啉，是一種顯色劑，它與Fe2+在pH2.0-6.0溶液中形成橙紅色配合物，該絡(luò)合物在PH值為3-4.5時最為穩(wěn)定( 避光情況下可穩(wěn)定半年)，普通實驗條件下8h內(nèi)溶液的吸光度沒有變化[12]。鄰菲羅啉能與某些金屬離子形成有色絡(luò)合物而干擾測定。但在乙酸——乙酸胺的緩沖溶液中，不大于鐵濃度10倍的銅、鋅、鈷、鉻及小于2 mg／L的鎳，不會干擾測定[13]。本實驗條件相對容易控制，顯色后溶液的穩(wěn)定性好，方法簡單易行。</

42、p><p>　　測定結(jié)果如表1所示，鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。</p><p>　　表1 鄰菲啰啉法測定微量鐵試驗的結(jié)果</p><p>　　Table 1 The of results Phenanthroline Method for the Determination of iron test </p><p>　　注：其中樣品1為腦心浸液培養(yǎng)

43、基，樣品2為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。</p><p>　　圖1 鄰菲啰啉法測定微量鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線</p><p>　　Figure 1 The standard curve Phenanthroline Method for the Determination of iron </p><p>　　由圖1可以得出吸光度與濃度的線性方程為：y=0.0215x，相關(guān)系數(shù)r=0.99

44、27，按方程計算得出x1=3.62 μg/ml，x2=0.21 μg/ml，樣品中鐵的含量按式1計算</p><p>　　XFe（mg/kg）=m/W 式1</p><p>　　式中：m為從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得的鐵的質(zhì)量（µg）；</p><p>　　W為測定時用品的質(zhì)量（g）。</p><

45、;p>　　求得腦心浸液培養(yǎng)基中XFe =1.81×50×100/5=1810.00 mg/kg。同理求得營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)中XFe=20.93 mg/kg。</p><p>　　3.2 四種菌的適宜鐵濃度</p><p>　　鐵是微生物生長必需的微量元素之一。細胞內(nèi)許多的蛋白質(zhì)，特別是一些酶類，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、核糖核苷酸還原酶等，都是含鐵蛋白質(zhì)

46、，鐵及其相關(guān)的化合物是相當(dāng)重的酶輔基[14]。從呼吸鏈到核糖核苷酸的生物合成等細胞內(nèi)一系列重要的代謝活動都與鐵離子有關(guān)。鐵在微生物生長過程中作用主要有：①構(gòu)成有機化合物，合成菌體組分；②作為酶的組成成分，維持酶的活性；③參與能量的儲存于轉(zhuǎn)運；④調(diào)節(jié)細胞的滲透壓；⑤與微生物生長繁殖和致病作用密切相關(guān)[15]。通過該實驗了解不同的鐵濃度對微生物生長的影響。</p><p>　　3.2.1 適宜鐵濃度分析</p&

47、gt;<p>　　在基本培養(yǎng)基中加入直接加入硫酸亞鐵來培養(yǎng)菌的，用分光光度法測OD值以及稀釋到平板法，四種菌均不生長。而在基本培養(yǎng)基中加入不同量的腦心浸液培養(yǎng)基，測其OD值結(jié)果梯度不明顯，分析其原因可能是隨著腦心浸液培養(yǎng)基加入量的增加，培養(yǎng)基顏色會逐漸增加，并且會逐漸渾濁，因而影響實驗結(jié)果的測定。圖2所示為四種菌在基本培養(yǎng)基中加入不同量的腦心浸液培養(yǎng)基用稀釋到平板法所測得的結(jié)果，其中X軸表示，根據(jù)加入的腦心浸液培養(yǎng)基含量計

48、算得出加入鐵的含量腦心浸液培養(yǎng)基中鐵含量為1810.00mg/kg，由鄰菲啰啉法測得），Y軸表示菌落數(shù)。</p><p>　　圖2 四種菌最適鐵生長濃度結(jié)果曲線</p><p>　　Figure 2 The curve of four bacterias’ most suitable concentration of iron </p><p>　　從上圖可知，蠟樣

49、芽孢桿菌的最適鐵生長濃度為20mg/L，大腸桿菌的最適鐵生長濃度為40mg/L，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的最適鐵生長濃度為60mg/L，且四種菌的最適鐵濃度條件下，其生長情況均不如在純腦心浸液培養(yǎng)基中好，大腸桿菌的情況尤為明顯。同時，我們也可以看到，當(dāng)鐵含量達到一定濃度之后，隨著鐵加入量的增加，螯合劑對于這四種菌的促進作用并不增長。查閱文獻也發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基中添加一定量的鐵鹽，可提高酵母體內(nèi)鐵元素的含量，并且提高酵母活性，但超過一

50、定的范圍反而對酵母的生長有抑制作用[16]。</p><p>　　3.2.2 加入鐵離子價態(tài)選擇說明</p><p>　　細胞內(nèi)許多氧化還原酶都是以二價鐵為輔基。細菌在攝取利用環(huán)境中的Fe3+時，也是先將其還原成Fe2+之后再釋放，盡管這是一個消耗能量的過程[14]。朱才慶[17]等人在葡萄糖為碳源的M 培養(yǎng)基中添加FeCl3或FeSO4，發(fā)現(xiàn)無論是Fe2+ 還是Fe3+都能使DH5α和D

51、A19細胞生長改善，菌體得率增加，但是添加Fe2+效果比Fe3+明顯。因此在本次實驗過程當(dāng)中選擇在基本培養(yǎng)基中直接加入FeSO4，然而結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其培養(yǎng)效果很差，四種細菌均不能正常生長?，F(xiàn)推測，可能是由于基本培養(yǎng)基中用磷酸鹽作為緩沖液，F(xiàn)e2+加入后會形成沉淀，細菌幾乎不能利用，因而最終不能生長。而在基本培養(yǎng)中加入腦心浸液培養(yǎng)基，其中含有的鐵多為生物結(jié)合態(tài)，不容易與磷酸鹽形成沉淀，并能直接被微生物所利用。在前面的實驗中，已經(jīng)測出腦心浸液培

52、養(yǎng)中鐵的含量，因此可以根據(jù)加入的腦心浸液培養(yǎng)基量來確定微生物的最適鐵生長濃度。</p><p>　　3.3 培養(yǎng)基的選擇</p><p>　　從上文可以看出，腦心浸液培養(yǎng)基中鐵含量達到1810mg/kg，含量十分豐富，而普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中鐵含量僅為20.93 mg/kg，含量較少。同時我也對這兩種培養(yǎng)基的培養(yǎng)能力作了一個比較，分別從細菌濃度為107菌懸液中吸取50μl菌液至5ml的牛肉膏

53、蛋白胨培養(yǎng)基和腦心浸液培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)24h后，選取三個連續(xù)的適宜的稀釋度，吸取50μL稀釋液加到培養(yǎng)皿中，倒上培養(yǎng)基。并做兩個平行。等待培養(yǎng)基干后倒置放到培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，第二天平板計數(shù)。結(jié)果如圖4所示：</p><p>　　圖4 普通營養(yǎng)瓊脂和腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)能力比較</p><p>　　Figure 4 ordinary nutrient agar and brain he

54、art infusion culture medium capacity compare</p><p>　　從上圖我們可以明顯看出普通營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)能力遠遠不如腦心浸液培養(yǎng)基的培養(yǎng)能力。由此看來，腦心浸液培養(yǎng)基因其富含鐵而適宜細菌生長，因此鐵螯合實驗選擇用腦心浸液培養(yǎng)基來培養(yǎng)菌。</p><p>　　3.4 螯合劑的抑制效果</p><p>　　大腸桿菌、金黃色葡

55、萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抑制曲線結(jié)果如下圖所示：</p><p>　　表2-1 四種抗菌劑對大腸桿菌抑制率%</p><p>　　Table 2-1 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Escherichia coli</p><p>　　注：大腸桿菌原菌液濃度為3.24×

56、;106CFU</p><p>　　表2-2 四種螯合劑對金黃色葡萄球菌抑制率%</p><p>　　Table 2-2 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Staphylococcus aureus</p><p>　　注：金黃色葡萄球菌原菌液濃度為3.79×106CFU</

57、p><p>　　表2-3 四種螯合劑對蠟樣芽孢桿菌抑制率%</p><p>　　Table 2-3 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Bacillus cereus</p><p>　　注：蠟樣芽孢桿菌原菌液濃度為3.66×106CFU</p><p>　　表2

58、-4四種螯合劑對銅綠假單胞菌抑制率%</p><p>　　Table 2-4 The rate of inhibition of four antimicrobial agents on Pseudomonas aeruginosa</p><p>　　注：銅綠假單胞菌原菌液濃度為3.59×106CFU</p><p>　　圖3-1 大腸桿菌的抑制曲線&l

59、t;/p><p>　　Figure 3-1 Inhibition curves of Escherichia coli</p><p>　　圖3-2金黃色葡萄球菌的抑制曲線</p><p>　　Figure 3-2 Inhibition curves of Staphylococcus aureus</p><p>　　圖3-3蠟樣芽胞桿菌抑制曲

60、線</p><p>　　Figure 3-3 inhibition curves of Bacillus cereus</p><p>　　圖3-4銅綠假單胞菌抑制曲線</p><p>　　Figure 3-4 inhibition curves of Pseudomonas aeruginosa</p><p>　　從表2-1、2-2、2-

61、3、2-4及圖3-1、3-2、3-3、3-4可以看出幾種螯合劑對四種菌均有不同程度的抑制，從單個菌來看，DTPA的抑制效果最好。而從單個螯合劑來看，這幾種螯合劑對蠟樣芽胞桿菌的抑制效果最好，對金黃色葡萄球菌的抑制效果次之，對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑制效果較差。所有的抑菌劑均不能完全抑制細菌的生長。</p><p>　　3.4.1 細胞結(jié)構(gòu)對抗菌效果的影響 </p><p>　　實驗發(fā)現(xiàn)，

62、這五種螯合劑對于革蘭氏陽性菌的抑制效果好于對革蘭氏陰性菌的抑制效果。特別是DTPA，對于金黃色葡萄球菌，當(dāng)濃度達到1500μg/ml時，能使菌液濃度從1.6×105cfu/mL減少到5.6×103cfu/mL，抑制率達到51%；對于蠟樣芽孢桿菌，當(dāng)濃度達到2000μg/ml，使菌液濃度從3.0×105cfu/mL減少到1.3×103cfu/mL，抑制率達到53%。而對于大腸桿菌和銅綠假單胞菌，DT

63、PA的濃度需達到2500μg/ml，才能使抑制率達到50%以上。</p><p>　　我們知道，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌最大的差異就是它們細胞壁結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陽性菌細胞壁較厚（20~80nm），主要由肽聚糖構(gòu)成，多達20層，占細胞壁成分60~90%，它同細胞膜的外層緊密相連，有的革蘭氏陽性菌細胞壁中含有磷壁酸，也稱胞壁質(zhì)，它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸帶負電荷，它在細

64、胞表面能調(diào)節(jié)陽離子濃度。革蘭氏陽性菌的細胞壁雖然結(jié)構(gòu)堅固，但是細胞壁的選擇透過性是比較差的。所以當(dāng)嗜鐵素和這類抗菌劑跟三價鐵離子結(jié)合時，此種復(fù)合物還是能通過ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)進入到膜內(nèi)，促進革蘭氏陽性菌對培養(yǎng)基中鐵離子的利用。ABC轉(zhuǎn)運系統(tǒng)又稱ATP結(jié)合性盒型轉(zhuǎn)運蛋白（ATP—binding—cassette，ABC），ABC系統(tǒng)可以促進嗜鐵素復(fù)合物通過膜，其中所需的能量來自細胞ATP的水解[18]。相似的過程發(fā)生在革蘭氏陰性菌穿過內(nèi)膜時。

65、</p><p>　　但是，革蘭氏陰性菌有另外的脂雙層結(jié)構(gòu)，使得轉(zhuǎn)運過程更為復(fù)雜，鐵—嗜鐵素復(fù)合物必須通過外膜和內(nèi)膜時才能進入細胞質(zhì)。外膜是一層曲折呈波狀的結(jié)構(gòu)，厚度約為8~ 10nm，其基本成分是脂多糖，結(jié)構(gòu)類似細胞膜，為液態(tài)的雙層脂質(zhì)外膜中還含有幾種蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用，調(diào)控外界分子進入。外膜中鑲嵌有一種特殊的蛋白—微孔蛋白，穿過外膜的內(nèi)外雙層，構(gòu)成三面體，中間形成微小的孔道。外膜是

66、革蘭氏陰性菌細胞壁的主要結(jié)構(gòu)，其功能除保障運輸外，還有保護屏障作用，能阻止多種物質(zhì)透過，抗御許多化學(xué)藥物的影響，故革蘭氏陰性菌對多種抗生素具有很強的抵抗力[19]，營養(yǎng)物質(zhì)通過外膜通常是由微孔蛋白來完成的。相對小的分子和可溶的離子被動擴散進入膜內(nèi)，有時候需要低親和性的結(jié)合位點。但是鐵—嗜鐵素—抗菌劑的復(fù)合物在生理條件下外部基質(zhì)中濃度非常低，并且相對分子較大，不能通過被動擴散進入，它的轉(zhuǎn)運需要受體和能量的參與。當(dāng)鐵、嗜鐵素和抗菌劑三者結(jié)合

67、時，外膜上的受體就無法識別此種復(fù)合物，所以，微生物鐵的運輸路徑就被阻斷，即使培養(yǎng)基中的鐵離子濃度很高，但是微生物利用不了，生長即被抑制，從而達到了抗菌的目的。</p><p>　　3.4.2 蠟樣芽孢菌抗性對抗菌效果的影響</p><p>　　一般認(rèn)為，芽孢菌的抗性較強，但是在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)螯合劑對蠟樣芽孢菌的抗性好于非芽孢菌。以金黃色葡萄球菌與蠟樣芽孢桿菌作比較，當(dāng)抗菌劑的濃度達到2

68、000μg/ml時，SXF、CPD02、TZ-57和TZ-58對蠟樣芽孢桿菌的抑制率均大于金黃色葡萄球菌的抑制率。查閱資料發(fā)現(xiàn)，芽孢菌的較強的抗性一般來自于芽孢，而細胞本身抗性與非芽孢菌相差無幾。一般認(rèn)為，芽孢是自生長后期、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時形成時，因而是適應(yīng)不良環(huán)境的產(chǎn)物。也有學(xué)者在培養(yǎng)枯草桿菌時，曾作過追蹤觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種培養(yǎng)4h后即有芽孢生成。以后每隔4h觀察一次，芽孢數(shù)呈比例增長。至24h，約半數(shù)產(chǎn)生芽孢。這種情況表明，在此情

69、形下營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)向芽孢形成有一定的概率。但是剛剛形成的芽孢總是處于休眠狀態(tài)，并不能完全萌發(fā)，而菌體本身對于抗菌劑的抵抗能力不強。另外一種可能就是，鐵離子影響芽孢的形成，因而導(dǎo)致蠟樣芽孢桿菌抗性的降低。但這還需要進一步驗證。</p><p>　　3.4.3 細菌適宜生長鐵濃度對抗菌效果的影響</p><p>　　查閱文獻發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌與銅綠假單胞菌攝取鐵的機制相同，都是合成嗜鐵素后分泌到胞外去

70、螯合鐵，然后結(jié)合到外膜受體上。這些受體高親和地和它們的配體即鐵——嗜鐵素結(jié)合，逆濃度特異性地轉(zhuǎn)運鐵復(fù)合物。大腸桿菌的外膜受體有FepA、FhuA等，而銅綠假單胞菌具有多個系統(tǒng)來感應(yīng)和攝取其周圍環(huán)境中的鐵，并通過一類正負調(diào)控因子來調(diào)節(jié)細胞的鐵攝取和儲存。兩個研究得相對透徹的攝鐵系統(tǒng)是高親和力pyoverdine系統(tǒng)及低親和力pyochelin系統(tǒng)。這兩個系統(tǒng)分泌的pyoverdine和pyochelin蛋白與細胞外鐵(Fe3+ )結(jié)合后，

71、共同轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，調(diào)節(jié)胞內(nèi)鐵離子的濃度[20]。Pyochelin能親和多種金屬離子，如Mo6+，Co2+，F(xiàn)e3+等；Pyoverdine則特異性負責(zé)對鐵離子的結(jié)合和轉(zhuǎn)運[21]。在培養(yǎng)基中加入此種抗菌劑后，抗菌劑開始螯合培養(yǎng)基中的鐵離子。當(dāng)培養(yǎng)基中的鐵離子越來越少時，大腸桿菌和銅綠假單胞菌分泌出相應(yīng)的嗜鐵素，促進該菌對鐵離子的吸收利用?，F(xiàn)推測，它們分泌的嗜鐵素對鐵離子的螯合能力不如這些抗菌劑，故而生長受到嚴(yán)重的抑制。其中但是從抑制結(jié)

72、果看，DTPA、SXF、CPD02、T</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　腦心浸液培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，適合培養(yǎng)難養(yǎng)菌。通過鄰菲羅啉法測得其中鐵含量高達1810.00mg/kg。而普通的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中其鐵含量僅為20.93 mg/kg。腦心浸液培養(yǎng)基在相同條件下對同種菌的培養(yǎng)效果要遠遠好于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。</p><

73、p>　　在基本培養(yǎng)基中加入FeSO4，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌四種菌均不能正常生長。而加入腦心浸液培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌的最適鐵生長濃度為20mg/L，大腸桿菌的最適鐵生長濃度為40mg/L，金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的最適鐵生長濃度為60mg/L，且四種菌的最適鐵濃度條件下，其生長情況均不如在純腦心浸液培養(yǎng)基中好，大腸桿菌的情況尤為明顯。</p><p>　　DTPA、SX

74、F、CPD02、TZ-57和TZ-58五種鐵螯合劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、銅綠假單胞菌四種菌均有一定的抑制作用，同時也發(fā)現(xiàn)這五種螯合劑均不能完全一致細菌的生長。對于革蘭氏陽性菌的抑制效果要好于革蘭氏陰性菌的抑制效果。SXF、CPD02、TZ-57和TZ-58四種鐵螯合劑的效果不如已經(jīng)商品化的DTPA。</p><p>　　鐵螯合劑是通過螯合環(huán)境中鐵，來降低細菌可利用的鐵的含量來達到抗菌的效果。鐵

75、螯合劑對于細胞本身是否有毒害作用，如用于食品消毒是否會影響食品成分，攝入人體內(nèi)后是否會影響人體健康將是今后需要深入研究的課題。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1] 李和平,王月影,高峰霞. 綠色抗菌劑——殼聚糖[J]. 畜牧與飼料科學(xué), 2009,30(6):179~180.</p><p>　　[2] K

76、ourai. Synthesis and Antibacterial Activity of Unsaturated Quaternary Ammonim[J]. Bok in bobia, 1995, (23): 271.</p><p>　　[3] Robert RC , Mirele CW.Iron Wansport and storage[J].Eur J Biochem,1987,164:485~06.

77、</p><p>　　[4] 楊天潼,于曉軍,楊宏生.鐵與營養(yǎng)免疫[J].免疫學(xué)雜志,2004,20(3),129~131.</p><p>　　[5] 李國剛.靜脈補鐵在腎性貧血治療中的應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)·泌尿系統(tǒng)分冊,2001,21(2):51~53.</p><p>　　[6] Sunder G, Patruta SI, Hod WH, et al

78、. Pathobiology of the role of iron in infection[J]. Am J Kidney Dis,1999,34(4 supply 2):S25-S29</p><p>　　[7] 錢鐘明主編.鐵代謝——基礎(chǔ)與臨床[M].北京:科學(xué)出版社,2000:364.</p><p>　　[8] Tom Bergan, Jo Klaveness. Chelati

79、ng Agents[J]. Chemotherapy. 2001, 47: 10~ 14.</p><p>　　[9]萬素英,李琳,王慧君.常用酚類抗氧劑和螯合劑的抑菌作用[J].中國食品添加劑,1998,(3):17~22.</p><p>　　[10] Min-Hua Feng,Leen van der Does,Adriaan Bantjes.Iron(Ⅲ)-Chelating Re

80、sins.3.'Synthesis, Iron(Ⅲ)-Chelating Properties,and in Vitro Antibacterial Activity of Compounds Containing 3-Hydroxy-2-methyl-4(lH)-pyridinone Ligands[J]. Journal of Medicinal Chemistry,1993,36(19): 2822-2821.</p

81、><p>　　[11] 郭小群,譙康全,蔡述蘭,等. 鄰菲羅啉分光光度法測定自來水中的鐵(III)含量[J]. 四川理工學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2008,21(4):72~73.</p><p>　　姚淑敏.細菌的鐵供給研究[J]. 北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,4(3):214~216</p><p>　　[12] 朱慶珍,夏紅.分光光度法測定微量鐵實驗方法的

82、改進[J].實驗科學(xué)與技術(shù),2009,07(06):25~27.</p><p>　　[13] 郝新煥.鄰菲啰啉分光光度法測定污水中的總鐵[J].石油化工腐蝕與防護,2006,23(2):44~46.</p><p>　　[14] Guerinot M L.Microbial iron transport[J].Annu Rev Microbiol,1994,48:743~722.<

83、/p><p>　　[15] 陸德源主編.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)[M].5版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:29~30</p><p>　　[16] 張培茵,閻喜霜, 姜淑梅等.鐵、鋅對啤酒酵母生物特性的影響研究[J].食品工業(yè)科技[J],1996,(1):13~15.</p><p>　　[17] 朱才慶,葉勤. F e 2 + 和 F e 3 + 對大腸桿菌 DH5 a及其耐

84、乙酸突變株生長及乙酸生成的影響[J].華東理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2005,31(4):451~455.</p><p>　　[18] 王偉,肖明.微生物嗜鐵素介導(dǎo)的鐵攝取[J].生物學(xué)雜志,2005,22(4):11~15</p><p>　　[19] 吳金鵬. 食品微生物學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 1990.</p><p>　　[20] 蔡蕓,倪

85、淑欣,梁蓓蓓,等. 鐵離子在銅綠假單胞菌生物被膜形成中的作用[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2007, 12(8):861~864.</p><p>　　[21] J. L. SEBAT, A. J. PASZCZYNSKI, M. S. CORTESE, et al. Antimicrobial Properties of pyridine-2.6-Dithiocarboxylic Acid, a Meta