鐵離子對破骨細(xì)胞分化及骨吸收影響的機(jī)理研究.pdf

1、目的:探討鐵離子(Ferricion)在破骨細(xì)胞分化過程以及骨吸收中的作用，同時闡述其中可能存在的機(jī)理，以進(jìn)一步闡明鐵代謝與骨代謝之間的關(guān)系。
　　 方法:1.以RAW264.7作為破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，以枸櫞酸鐵銨(ferricammoniumcitrate，F(xiàn)AC)作為三價鐵離子供體，首先研究12uM、25uM、50uM、100uM、200uMFAC對RAW264.7增值活力的影響。2.在20ng/ml核因子kB受體活化因子配體

2、(RANKL)存在下，根據(jù)實驗1結(jié)果選取12uM、25uM、50uMFAC干預(yù)RAW264.7，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)觀察TRAP陽性細(xì)胞形成情況并計數(shù)（以細(xì)胞核≥3個為TRAP陽性細(xì)胞，即破骨細(xì)胞）。3.以2，7-DCF-DA作為細(xì)胞內(nèi)熒光探針，流式細(xì)胞儀檢測不同濃度FAC以及FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)RAW264.7后細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactiveoxygenspecies/ROS)水平。4．檢測FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)后

3、破骨細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量，以及還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。5．利用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)作為抗氧化劑，觀察FAC聯(lián)合NAC干預(yù)后對破骨細(xì)胞形成的影響。6．分別用RT-PCR、Westernblot檢測FAC以及FAC+NAC干預(yù)RAW264.7后TRAP、Cathepsin-K、NFATcl表達(dá)變化情況。7.選取24只雄性ICR小鼠，隨機(jī)分為3組，分別腹腔注射生理鹽水、FAC、FAC+NAC，建立對照

4、組、高鐵組、高鐵+抗氧化劑組小鼠模型。干預(yù)完成后取小鼠骨髓源性單核細(xì)胞進(jìn)行破骨細(xì)胞培養(yǎng)，觀察不同組別破骨細(xì)胞形成情況。8．取各組小鼠股骨進(jìn)行HE染色觀察骨小梁情況。9．用Miro-CT對各組小鼠股骨遠(yuǎn)端及股骨中段進(jìn)行掃描，并進(jìn)行三維圖像重建，分析各參數(shù)值。10.留取各小鼠血清，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清中鐵蛋白(Ferritin)、丙二醛(MDA)、8．羥基-鳥苷(8-OH-DG)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)、

5、一型膠原C端肽(CTX)、核因子kB受體活化因子配體/骨保護(hù)素(RANKL/OPG)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)水平。
　　 結(jié)果:1.12uM、25uM、50uMFAC對RAW264.7增值無抑制作用（P＞0.05），100uM、200uMFAC對RAW264.7有抑制作用(P＜0.05)。2．FAC能在一定范圍內(nèi)(0uM、12uM、25uM、50uM)促進(jìn)破骨細(xì)胞（TRAP陽性細(xì)胞）形成(P＜0.05)。3．

6、FAC能在一定范圍內(nèi)提高細(xì)胞內(nèi)活性氧，同時FAC和RANKL聯(lián)合干預(yù)也能提高RAW264.7細(xì)胞內(nèi)活性氧水平（P＜0.05）。4．FAC聯(lián)合RANKL干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽含量下降(P＜0.05)，GSH/GSSG上升(P＜0.05)。5．抗氧化劑NAC能部分抑制FAC對破骨細(xì)胞形成的促進(jìn)作用(P＜0.05)。6．RT-PCR、Westernblot結(jié)果提示FAC能上調(diào)TRAP、Cathepsin-K、NFATcl

7、的表達(dá)(P＜0.05)，NAC能部分抑制FAC介導(dǎo)的這一作用(P＜0.05)。7．利用動物模型骨髓源性單核細(xì)胞培養(yǎng)破骨細(xì)胞結(jié)果提示，高鐵組動物模型骨髓源性單核細(xì)胞形成的破骨細(xì)胞顯著多于正常對照組(P＜0.05)，而鐵離子和NAC聯(lián)合干預(yù)組形成的破骨細(xì)胞少于高鐵組(P＜0.05)。8．高鐵組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁較對照組稀疏，而NAC和鐵離子聯(lián)合干預(yù)組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁密度高于高鐵組。9．Micro-CT對小鼠股骨遠(yuǎn)端分析結(jié)果提示，高鐵組小鼠

8、股骨遠(yuǎn)端微觀結(jié)構(gòu)較對照組退變明顯，而NAC與鐵離子聯(lián)合干預(yù)組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨微觀結(jié)構(gòu)退變較輕。10.高鐵組小鼠血清中Ferritin、MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著高于對照組(P＜0.05)，而NAC和鐵離子聯(lián)合干預(yù)組MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著低于高鐵組(P＜0.05);相反，高鐵組小鼠血清中BALP、BGP含量明顯低于對照組(P＜0.05)，而鐵離子和N