鐵離子對破骨細胞分化及骨吸收影響的機理研究.pdf

1、目的:探討鐵離子(Ferricion)在破骨細胞分化過程以及骨吸收中的作用，同時闡述其中可能存在的機理，以進一步闡明鐵代謝與骨代謝之間的關系。
　　 方法:1.以RAW264.7作為破骨細胞前體細胞，以枸櫞酸鐵銨(ferricammoniumcitrate，FAC)作為三價鐵離子供體，首先研究12uM、25uM、50uM、100uM、200uMFAC對RAW264.7增值活力的影響。2.在20ng/ml核因子kB受體活化因子配體

2、(RANKL)存在下，根據實驗1結果選取12uM、25uM、50uMFAC干預RAW264.7，抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)觀察TRAP陽性細胞形成情況并計數（以細胞核≥3個為TRAP陽性細胞，即破骨細胞）。3.以2，7-DCF-DA作為細胞內熒光探針，流式細胞儀檢測不同濃度FAC以及FAC聯合RANKL干預RAW264.7后細胞內活性氧(Reactiveoxygenspecies/ROS)水平。4．檢測FAC聯合RANKL干預后

3、破骨細胞內總谷胱甘肽含量，以及還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比值(GSH/GSSG)。5．利用N-乙酰-半胱氨酸(NAC)作為抗氧化劑，觀察FAC聯合NAC干預后對破骨細胞形成的影響。6．分別用RT-PCR、Westernblot檢測FAC以及FAC+NAC干預RAW264.7后TRAP、Cathepsin-K、NFATcl表達變化情況。7.選取24只雄性ICR小鼠，隨機分為3組，分別腹腔注射生理鹽水、FAC、FAC+NAC，建立對照

4、組、高鐵組、高鐵+抗氧化劑組小鼠模型。干預完成后取小鼠骨髓源性單核細胞進行破骨細胞培養(yǎng)，觀察不同組別破骨細胞形成情況。8．取各組小鼠股骨進行HE染色觀察骨小梁情況。9．用Miro-CT對各組小鼠股骨遠端及股骨中段進行掃描，并進行三維圖像重建，分析各參數值。10.留取各小鼠血清，酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中鐵蛋白(Ferritin)、丙二醛(MDA)、8．羥基-鳥苷(8-OH-DG)、抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(TRAP-5b)、

5、一型膠原C端肽(CTX)、核因子kB受體活化因子配體/骨保護素(RANKL/OPG)、骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)水平。
　　 結果:1.12uM、25uM、50uMFAC對RAW264.7增值無抑制作用（P＞0.05），100uM、200uMFAC對RAW264.7有抑制作用(P＜0.05)。2．FAC能在一定范圍內(0uM、12uM、25uM、50uM)促進破骨細胞（TRAP陽性細胞）形成(P＜0.05)。3．

6、FAC能在一定范圍內提高細胞內活性氧，同時FAC和RANKL聯合干預也能提高RAW264.7細胞內活性氧水平（P＜0.05）。4．FAC聯合RANKL干預RAW264.7細胞后，細胞內總谷胱甘肽含量下降(P＜0.05)，GSH/GSSG上升(P＜0.05)。5．抗氧化劑NAC能部分抑制FAC對破骨細胞形成的促進作用(P＜0.05)。6．RT-PCR、Westernblot結果提示FAC能上調TRAP、Cathepsin-K、NFATcl

7、的表達(P＜0.05)，NAC能部分抑制FAC介導的這一作用(P＜0.05)。7．利用動物模型骨髓源性單核細胞培養(yǎng)破骨細胞結果提示，高鐵組動物模型骨髓源性單核細胞形成的破骨細胞顯著多于正常對照組(P＜0.05)，而鐵離子和NAC聯合干預組形成的破骨細胞少于高鐵組(P＜0.05)。8．高鐵組小鼠股骨遠端骨小梁較對照組稀疏，而NAC和鐵離子聯合干預組小鼠股骨遠端骨小梁密度高于高鐵組。9．Micro-CT對小鼠股骨遠端分析結果提示，高鐵組小鼠

8、股骨遠端微觀結構較對照組退變明顯，而NAC與鐵離子聯合干預組小鼠股骨遠端骨微觀結構退變較輕。10.高鐵組小鼠血清中Ferritin、MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著高于對照組(P＜0.05)，而NAC和鐵離子聯合干預組MDA、8-OH-DG、TRAP-5b、CTX、RANKL/OPG顯著低于高鐵組(P＜0.05);相反，高鐵組小鼠血清中BALP、BGP含量明顯低于對照組(P＜0.05)，而鐵離子和N