桂花種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及品種鑒定.pdf

1、本文從形態(tài)學(xué)、DNA分子標(biāo)記、DNA序列三個(gè)方面，以無(wú)錫、南京、杭州和湖南瀏陽(yáng)的88個(gè)桂花（Osmanthus fragrans Lour.）栽培品種、野生桂花、木犀屬(Osmanthus)2個(gè)對(duì)照種柊樹(shù)(O.heterophyllus(G.Don.)P.S.Green)和華東木犀(O.cooperi Hemsl.)為材料，對(duì)桂花種質(zhì)資源的遺傳多樣性、親緣關(guān)系、品種分類(lèi)鑒定等問(wèn)題進(jìn)行了研究和探討。建立并優(yōu)化了桂花的SRAP擴(kuò)增體系。利用

2、SRAP和ISSR分子標(biāo)記研究了桂花種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。測(cè)定了野生桂花及部分桂花品種的ITS序列和trnL-F序列，并用兩個(gè)序列聯(lián)合分析的方式，以木犀屬的柊樹(shù)和華東木犀為外類(lèi)群，初步探討了桂花四個(gè)品種群之間的親緣關(guān)系。依據(jù)形態(tài)特征編制了88個(gè)桂花品種的分類(lèi)檢索表，分別運(yùn)用SRAP和ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建了桂花的DNA指紋圖譜，旨在為桂花品種的鑒定、培育和開(kāi)發(fā)利用，提供形態(tài)和分子依據(jù)。研究的主要內(nèi)容如下：
　　 1.桂花

3、SRAP擴(kuò)增體系的建立及遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究
　　 以早銀桂為材料，通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增體系中模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶進(jìn)行單因子不同濃度梯度的比較試驗(yàn)，建立了適合桂花基因組DNA的SRAP-PCR優(yōu)化體系。結(jié)果表明，在10μL反應(yīng)體系中，SRAP-PCR優(yōu)化體系中各因子適宜濃度為：模板DNA30ng、Mg2+2.5mmol·L1、dNTPs0.2mmol·L-1、引物0.4μmol.L-1、Ta

4、qDNA聚合酶0.75U。
　　 運(yùn)用SRAP優(yōu)化體系，以柊樹(shù)和華東木犀為對(duì)照種，研究了桂花88個(gè)品種和野生桂花的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。18對(duì)SRAP引物共獲得296個(gè)位點(diǎn)，其中248個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)性比率達(dá)83.78％。平均每對(duì)引物組合產(chǎn)生16.4個(gè)位點(diǎn)、13.8個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。其中，銀桂品種群的Shannon信息指數(shù)(0.3412)、遺傳多樣性指數(shù)(0.2191)和位點(diǎn)多態(tài)性比率(84.46％)最高。桂花遺傳分化系數(shù)為52

5、.95％，說(shuō)明大部分變異存在于品種群之間。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，以遺傳相似系數(shù)0.762為截值，可將91份種質(zhì)分成6類(lèi)。各品種群的品種基本先聚在一起。四季桂品種群與秋季開(kāi)花的三個(gè)品種群之間的遺傳距離較遠(yuǎn)。色質(zhì)較深的金桂往往與丹桂品種群的多個(gè)品種聚在一起?；赟RAP分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果與基于形態(tài)的傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的結(jié)果基本相符。說(shuō)明將桂花的栽培品種根據(jù)開(kāi)花季節(jié)、花序類(lèi)型和花色等不同，劃分為四季桂、銀桂、金桂和丹桂四個(gè)品種群是可行的。
　　

6、2.桂花遺傳多樣性及親緣關(guān)系的ISSR分析
　　 利用ISSR分子標(biāo)記，以柊樹(shù)和華東木犀為對(duì)照種，研究了桂花88個(gè)品種和野生桂花的遺傳多樣性及親緣關(guān)系。28個(gè)ISSR引物共獲得286個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)269個(gè)，多態(tài)性比率達(dá)94.06％。在四個(gè)品種群中，銀桂品種群的Shannon信息指數(shù)(0.3884)、遺傳多樣性指數(shù)(0.2532)和位點(diǎn)多態(tài)性比率(87.41％)最高。桂花遺傳分化系數(shù)為56.84％，說(shuō)明大部分變異存在于品種

7、群之間。聚類(lèi)分析結(jié)果表明，以遺傳相似系數(shù)0.720為截值，可將91份種質(zhì)分成7類(lèi)。各品種群的品種基本先聚在一起。四季桂品種群與秋季開(kāi)花的三個(gè)品種群遺傳距離較遠(yuǎn)。色質(zhì)較深的金桂往往與丹桂品種群的品種聚在一起?；贗SSR分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果與基于形態(tài)的傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的結(jié)果基本相符。說(shuō)明將桂花的栽培品種根據(jù)開(kāi)花季節(jié)、花序類(lèi)型和花色等不同，劃分為四季桂、銀桂、金桂和丹桂四個(gè)品種群是可行的。
　　 3.桂花SRAP與ISSR遺傳多樣性及親緣關(guān)

8、系比較分析
　　 基于SRAP和ISSR兩種分子標(biāo)記的桂花遺傳多樣性有異同。結(jié)果表明，每對(duì)SRAP引物較每個(gè)ISSR引物擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)多（16.4個(gè)），而ISSR標(biāo)記的位點(diǎn)多態(tài)性比率較高(94.06％)。兩種標(biāo)記皆表明：在四個(gè)品種群中，銀桂品種群的觀察等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Nei＇s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)和位點(diǎn)多態(tài)性比率均最高，其次為金桂。位點(diǎn)多態(tài)性比率排序均為：銀桂品種群＞金桂品種群＞丹桂品種群＞四季桂品種

9、群。兩種標(biāo)記均表明變異主要存在于品種群之間，四季桂品種群與秋季開(kāi)花的銀桂、金桂和丹桂品種群關(guān)系較遠(yuǎn)；丹桂品種群與四季桂品種群的遺傳距離最遠(yuǎn)，與金桂品種群距離最近?；赟RAP和ISSR分子標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果與基于形態(tài)的傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的結(jié)果基本相符。利用SRAP標(biāo)記得到的聚類(lèi)結(jié)果與形態(tài)分類(lèi)更為接近。本研究?jī)蓚€(gè)標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果均表明，無(wú)錫梅園的幾個(gè)桂花品種桃葉齒銀桂、竹葉銀桂、多裂銀桂、五瓣銀、銀十字、圓瓣籽金、球橙和銀丹，以及南京林業(yè)大學(xué)的冬香白，

10、不但形態(tài)上有別于其他品種，在基因組水平上也與其他品種存在一定差異，因此從分子生物學(xué)角度進(jìn)一步證實(shí)可以確立為新品種。
　　 4.基于ITS和trn L-F序列的桂花親緣關(guān)系的分子系統(tǒng)學(xué)初步研究
　　 通過(guò)PCR直接測(cè)定法測(cè)定了分屬四個(gè)品種群的4個(gè)桂花品種、桂花野生種的ITS序列和trnL-F序列，又在測(cè)序基礎(chǔ)上，比較了銀桂品種群內(nèi)6個(gè)品種的ITS序列。以木犀屬的格樹(shù)、華東木犀為外類(lèi)群，分析了兩個(gè)序列的特點(diǎn)；將ITS序列和t

11、rnL-F序列進(jìn)行聯(lián)合分析，用UPGMA法構(gòu)建了供試物種的分子系統(tǒng)樹(shù)以探討桂花四個(gè)品種群之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，所測(cè)物種的ITS序列全長(zhǎng)在620～650bp之間，經(jīng)排序后，兩端切平，得到617bp的整齊序列；變異位點(diǎn)17個(gè)、信息位點(diǎn)2個(gè)，分別占全序列的2.76％、0.32％。所測(cè)物種的trnL-F序列全長(zhǎng)在860～900bp之間，經(jīng)排序后，兩端切平，得到846bp的整齊序列；變異位點(diǎn)11個(gè)、信息位點(diǎn)4個(gè)，分別占總序列長(zhǎng)度的1.28％和

12、0.47％。6個(gè)銀桂品種之間的ITS序列變異極少，推測(cè)ITS序列尚無(wú)法揭示桂花同一品種群內(nèi)品種間的親緣關(guān)系。用ITS和trnL-F序列聯(lián)合分析的方式可在一定程度上揭示桂花四個(gè)品種群之間的親緣關(guān)系。在秋桂類(lèi)中，丹桂品種群與四季桂品種群親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與金桂品種群親緣關(guān)系最近；在四個(gè)品種群中，丹桂品種群與野生桂花親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，支持多位學(xué)者根據(jù)形態(tài)分類(lèi)得出的丹桂品種群在秋桂中最進(jìn)化的結(jié)論。ITS和trnL-F序列中皆有一些位點(diǎn)可用于區(qū)別柊樹(shù)、華

13、東木犀與桂花（野生種和品種），或者野生桂花與部分栽培品種。
　　 5.基于形態(tài)學(xué)和DNA指紋圖譜的桂花品種鑒定
　　 依據(jù)形態(tài)學(xué)構(gòu)建的桂花品種檢索表和依據(jù)分子標(biāo)記構(gòu)建的桂花DNA指紋圖譜，可以分別作為桂花種質(zhì)資源鑒定的形態(tài)依據(jù)和分子依據(jù)。
　　 桂花的不同品種在形態(tài)上有明顯區(qū)別。在花期、開(kāi)花習(xí)性、花（花序、花型、花徑、花色、花香、雌雄蕊的結(jié)實(shí)性）、果實(shí)和種子、葉、枝、樹(shù)干等方面，都顯著不同。有些性狀非常穩(wěn)定，可以

14、作為桂花品種分類(lèi)和鑒定的重要形態(tài)依據(jù)。根據(jù)開(kāi)花季節(jié)、花序類(lèi)型和花色等不同，將88個(gè)桂花品種劃歸四季桂、銀桂、金桂和丹桂四個(gè)品種群。依據(jù)桂花四個(gè)品種群及各品種的主要鑒別特征，編制了桂花88個(gè)品種的分類(lèi)檢索表。并對(duì)無(wú)錫梅園和南京林業(yè)大學(xué)的7個(gè)待定新品種進(jìn)行了形態(tài)描述。
　　 分別運(yùn)用SRAP-PCR體系和18對(duì)SRAP引物，以及ISSR-PCR體系和28個(gè)ISSR引物，以柊樹(shù)和華東木犀為對(duì)照種，研究了桂花88個(gè)品種和野生桂花特有的S

15、RAP和ISSR分子標(biāo)記，并將兩對(duì)SRAP引物pm17-em10和sa15-em10結(jié)合起來(lái)構(gòu)建了桂花的SRAP指紋圖譜，將兩個(gè)ISSR引物ISSR12和ISSR27結(jié)合起來(lái)構(gòu)建了桂花的ISSR指紋圖譜。結(jié)果表明，76個(gè)桂花品種、野生桂花及對(duì)照種柊樹(shù)和華東木犀均有特別的SRAP條帶；64個(gè)桂花品種、野生桂花及對(duì)照種柊樹(shù)和華東木犀均有特別的ISSR條帶，這些條帶作為部分供試材料特有的SRAP和ISSR標(biāo)記，可用于桂花種質(zhì)的分子鑒定。構(gòu)建的

16、桂花SRAP指紋圖譜和ISSR指紋圖譜，均可將91份種質(zhì)有效區(qū)分開(kāi)，并可作為桂花種質(zhì)鑒定的分子依據(jù)。將基于形態(tài)學(xué)的品種檢索表與基于分子標(biāo)記的DNA指紋圖譜結(jié)合起來(lái)可以對(duì)桂花種質(zhì)資源進(jìn)行更準(zhǔn)確有效的鑒定。
　　 形態(tài)學(xué)、DNA分子標(biāo)記、DNA序列三方面的研究結(jié)果均表明：桂花種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富，桂花的不同品種和品種群不論在形態(tài)上還是分子水平都存在明顯差異。丹桂品種群與四季桂品種群距離最遠(yuǎn)，與金桂品種群親緣關(guān)系最近?；赟RAP

17、和ISSR分子標(biāo)記的品種聚類(lèi)圖均表明，將桂花的栽培品種根據(jù)開(kāi)花季節(jié)、花序類(lèi)型和花色等不同，劃分為四季桂、銀桂、金桂和丹桂四個(gè)品種群是可行的，但花色僅為分類(lèi)的依據(jù)之一，還需考慮其他性狀。
　　 三方面的研究結(jié)果表明：桂花的品種分類(lèi)、品種群演化及品種親緣關(guān)系相當(dāng)復(fù)雜，不同的手段往往得出不同結(jié)論。今后，應(yīng)在傳統(tǒng)的形態(tài)分類(lèi)基礎(chǔ)上，綜合解剖學(xué)、孢粉學(xué)、數(shù)量分類(lèi)、分子標(biāo)記、DNA序列等多種分類(lèi)方法，并采用充足且可靠的材料，相互印證，綜合分類(lèi)