豬Reg3和Reg4基因的克隆與Reg4 Variant2的原核表達.pdf

1、Reg3、Reg4是再生基因家族(Reg)的新成員,是近年來新發(fā)現(xiàn)的再生基因家族(Reg)的新成員。再生基因家族(regenerating islet-derived family,REG或Reg)于1988年首次由Terazono等從大鼠再生胰島的cDNA文庫分離得到,屬于鈣依賴性凝集素超家族(C-type lectin super family),編碼的一種分泌蛋白可以刺激胰島p細胞的生長。目前的研究發(fā)現(xiàn),Reg蛋白可能不僅對B細胞

2、再生非常關(guān)鍵,而且還在哺乳動物其他生理和病理活動中起調(diào)節(jié)作用,如對肝臟、胃腸道、胰腺細胞起促增殖,抗凋亡作用,此外,與糖尿病、炎癥和創(chuàng)傷也有關(guān)。根據(jù)Reg基因編碼蛋白的一級結(jié)構(gòu),Reg家族可分為4個型:Reg1、Reg2、Reg3及Reg4,應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對Reg家族成員進行蛋白序列的比較顯示,4個成員在一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果均相似,說明它們在進化上的保守性。
　　 為了研究Reg在豬體內(nèi)是否具有同樣的功能,我們克隆了豬

3、Reg3、Reg4基因,并得到了相應(yīng)的融合蛋白,試驗分兩個部分。
　　 一、豬Reg3、Reg4基因的克隆、序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用同源序列克隆原理設(shè)計一對克隆引物,對豬十二指腸黏膜組織提取的總RNA進行RT-PCR,將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆、測序,并進行序列分析；結(jié)果成功克隆了豬Reg3、Reg4基因,并注冊到GenBank(Accession.FJ531494

4、,FJ469910,FJ469911),初步檢測了在組織中的分布。
　　 二、豬Reg4 Variant2基因的原核表達。根據(jù)克隆序列設(shè)計一對表達引物,用PCR法從重組克隆載體中擴增出EcoRI/HindⅢ酶切位點的Reg4 Variant2片段,雙酶切后亞克隆至pET21b(+)載體,構(gòu)建重組原核表達載體pET21b(+)～Reg4 Vatiant2,轉(zhuǎn)化宿土菌E.coli BL21,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進行表達,SDS-PAGE鑒