RegⅢ和胰島素原雙基因聯(lián)合干預(yù)1型糖尿病的作用及機(jī)制研究.pdf

1、1型糖尿病(type1 diabetes mellitus,T1DM),又稱胰島素依賴性糖尿病,是一種由自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的以胰腺β細(xì)胞進(jìn)行性損傷和胰島素分泌絕對(duì)不足為主要特征的自身免疫性疾病。在T1DM發(fā)病初期,活化的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞大量浸潤(rùn)胰島,其釋放出的炎性介質(zhì),如Th1型細(xì)胞因子和NO等發(fā)揮協(xié)同作用,引起胰腺β細(xì)胞凋亡、壞死以及胰島素分泌異常等,進(jìn)而導(dǎo)致高血糖癥狀和其他T1DM并發(fā)癥的發(fā)生。目前常用

2、的1型糖尿病治療方法或多或少地均存在一定的不足,研究者們一直在致力于尋找更為安全有效的1型糖尿病治療方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,基因治療技術(shù)方興未艾,為1型糖尿病新型治療方法的研究開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。
　　胰島素原是1型糖尿病發(fā)病過(guò)程中唯一的β細(xì)胞特異性、原發(fā)性自身抗原,在驅(qū)動(dòng)自身免疫性β細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,它也是誘導(dǎo)免疫耐受的主要抗原。胰腺再生基因 Ⅲ(RegⅢ)是介導(dǎo)胰島β細(xì)胞再生的關(guān)鍵基因,它能夠刺激胰

3、腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為β細(xì)胞,在促進(jìn)胰島組織再生過(guò)程中起著重要的作用。
　　本研究選擇作用于1型糖尿病發(fā)病過(guò)程中兩個(gè)不同環(huán)節(jié)的關(guān)鍵靶點(diǎn)——胰島素原和RegⅢ基因,利用基因重組技術(shù)將其整合到含有雙啟動(dòng)子的pBudCE4.1真核表達(dá)載體上,以構(gòu)建含有 RegⅢ和胰島素原的雙基因質(zhì)粒pReg/PI;并通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)觀察pReg/PI質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況以及其對(duì)胰島β細(xì)胞株NIT-1細(xì)胞的作用;建立鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的1型糖

4、尿病小鼠模型,肌肉注射給予pReg/PI質(zhì)粒進(jìn)行治療,觀察pReg/PI雙基因質(zhì)粒對(duì)1型糖尿病小鼠的治療作用并初步探討其作用機(jī)制。
　　首先,利用RT-PCR技術(shù)從Balb/c小鼠基因組中調(diào)取胰島素原cDNA序列、雙酶切反應(yīng)從pCMV-RegⅢ質(zhì)粒中獲取RegⅢ cDNA序列,利用基因重組技術(shù)將RegⅢ cDNA和胰島素原cDNA分別插入空質(zhì)粒載體pBudCE4.1所含的兩個(gè)啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)中,以構(gòu)建pReg/PI雙基因質(zhì)粒

5、。瓊脂糖凝膠電泳和基因測(cè)序結(jié)果表明,RegⅢ cDNA和胰島素原cDNA均成功插入pBudCE4.1質(zhì)粒載體,插入方向正確,基因序列中未有點(diǎn)突變和讀碼框移發(fā)生,pReg/PI雙基因質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　其次,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pReg/PI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染cos-7細(xì)胞和NIT-1細(xì)胞,利用western blot技術(shù)檢測(cè)了RegⅢ蛋白和胰島素原在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況,結(jié)果表明,pReg/PI質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中高效地表達(dá)胰島素原和RegⅢ

6、蛋白;通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)和MTT法研究了pReg/PI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)NIT-1細(xì)胞增殖、高糖或細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)誘導(dǎo)的NIT-1細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)pReg/PI質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后能夠促進(jìn)NIT-1細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)NIT-1細(xì)胞的損傷反應(yīng),但是對(duì)高糖誘導(dǎo)的NIT-1細(xì)胞的凋亡并無(wú)明顯的改善作用。
　　最后,采用小劑量腹腔注射STZ的方法建立1型糖尿病動(dòng)物模型,肌肉注射給予pReg/PI質(zhì)粒治療5周,通過(guò)監(jiān)測(cè)小鼠血糖的變化來(lái)

7、觀察pReg/PI質(zhì)粒改善1型糖尿病癥狀的作用。研究發(fā)現(xiàn)在造模初期給予pReg/PI質(zhì)粒治療5周可明顯降低糖尿病小鼠的血糖并延緩1型糖尿病的發(fā)病時(shí)間。為了進(jìn)一步探討pReg/PI質(zhì)粒干預(yù)治療1型糖尿病的作用機(jī)制,對(duì)1型糖尿病小鼠的胰腺進(jìn)行了病理組織學(xué)分析、采用Tunel法原位檢測(cè)了胰島中細(xì)胞的凋亡情況并利用western blot技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白NF-κB和Bcl-2的表達(dá)情況、MTT法檢測(cè)脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)、FACS法檢測(cè)了小

8、鼠體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化情況、酶聯(lián)免疫法分析了糖尿病小鼠血清中胰島素、細(xì)胞因子(IL-2、IL-10、IFN-γ和TGF-β)分泌的改變。結(jié)果表明,給予pReg/PI質(zhì)粒進(jìn)行治療能夠抑制糖尿病小鼠的脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、減少胰島淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)并改善胰腺炎癥狀,通過(guò)減少促凋亡因子NF-κB的表達(dá)來(lái)抑制胰島細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)體內(nèi)CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和胰島素的分泌、恢復(fù)體內(nèi)Th1/Th2反應(yīng)