1型糖尿病大鼠Nfic與成骨成脂相關(guān)基因表達的探究及胰島素的干預作用.pdf

1、糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。機體血糖增高是由于胰島素分泌缺陷、生物作用受損或兩者協(xié)同作用所致。血糖水平增高可導致機體各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害與功能障礙。1型糖尿病(DM1)多發(fā)于兒童和青少年，表現(xiàn)為患者體內(nèi)胰島素絕對不足，必須依賴外源性胰島素降低血糖。1948年Albright和Reifenstein首次提出了糖尿病型骨質(zhì)疏松癥(Diabetic Oste

2、oporosis，DOP)這一概念，明確指出糖尿病患者血糖長期控制不良容易發(fā)生骨質(zhì)疏松。糖尿病型骨質(zhì)疏松癥是指在糖尿病基礎(chǔ)上并發(fā)骨量減少，骨脆性增加，骨顯微結(jié)構(gòu)受損的全身代謝性骨病。眾所周知，骨組織的改建與成熟主要由骨形成和骨吸收兩個過程不停地循環(huán)交替來完成。研究表明，DM1主要導致骨形成降低。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有成骨分化和成脂分化的能力。成骨分化受到眾多信號通路及相

3、關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的影響，其中Nfic為核因子I(Nuclear factor-Ⅰ，Nfi)家族的四個成員之一，過表達的Nfic可促使成骨細胞分化增加，新骨形成。此外，Nfic也可通過抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)的表達，抑制BMSCs的成脂分化，顯示出與年齡及激素水平相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥樣的表型。
　　本實驗主要研究:1、1

4、型糖尿病大鼠模型建立及首次建模失敗后的補救措施及其效果;2、糖尿病大鼠模型胰腺組織學改變及模型的穩(wěn)定性;3、1型糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關(guān)基因(Runx2、OSX、IGF-1、BMP-2)及成骨特異性標記基因(COL2A1、OC、ALP)的表達狀況;4、1型糖尿病大鼠成脂基因PPARγ的表達情況;5、Nfic基因表達變化對成骨相關(guān)基因及成脂基因PPARγ表達的影響;6、胰島素對1型糖尿病大鼠Nfic及成骨成脂基因表達的干預作用。<

5、br>　　第一部分:1型糖尿病大鼠模型的制備、建模失敗后補救措施及胰島素對大鼠模型的治療效果
　　目的：研究通過鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導建立1型糖尿病大鼠模型的方法及首次建模失敗后的補救措施及效果，并對胰島素對大鼠模型的干預作用進行初步探究。
　　方法:健康6～8周齡雄性Wistar大鼠30只，隨機分為2組，建模組25只，對照組5只。給予建模組大鼠一次性大劑量腹腔注射STZ(65mg/kg)，同

6、時對照組大鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸緩沖液。72h后檢測大鼠的血糖值判斷建模是否成功。首次建模成功的大鼠隨機分為兩組，模型組和治療組。治療組于實驗開始的第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。對首次建模失敗的大鼠常規(guī)飼養(yǎng)一周，再次腹腔注射STZ(65mg/kg)，并命名為補救組，觀察其成模狀況。分別在建模后第O、2、4、6、8周測量大鼠的體重與血糖并觀察其一般情況。于建模后第8周處死全部大鼠，取胰腺標本進行HE染色和胰島素

7、的免疫組化染色，觀察胰腺組織的病理學改變。
　　結(jié)果:1、體重狀況:模型組與補救組大鼠體重降低或保持不變，對照組及治療組大鼠體重增加明顯。2、血糖狀況:建模組有21只大鼠首次注射STZ72h后，血糖值達到成模標準(隨機血糖值≥16.7mmol/L)，4只血糖值未達到成模標準，再次注射STZ72h后血糖值檢測均達到成模標準。在建模成功組中隨機選取20只均分為模型組和治療組。持續(xù)觀察8周，模型組大鼠均成模穩(wěn)定，糖尿病癥狀明顯，未見血糖

8、轉(zhuǎn)復正常。治療組大鼠胰島素治療后，血糖由高血糖狀態(tài)降為正常水平。對照組大鼠各項指標均未見異常。3、胰腺組織細胞學觀察可見:對照組大鼠胰島形態(tài)規(guī)則，細胞數(shù)目正常。與對照組相比，模型組、治療組及補救組大鼠胰島形態(tài)不規(guī)則，體積萎縮變小，胰島內(nèi)分泌細胞數(shù)量明顯減少。補救組與模型組相比，其胰島形態(tài)更不規(guī)則。與模型組相比，治療組胰島體積稍大，內(nèi)分泌細胞排列更加整齊。4、免疫組化觀察:胰島素胰腺免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組和補救組胰島素分布

9、面積顯著減少。補救組與模型組相比，其胰島素分布面積略有增加。治療組胰島素分布面積略大于模型組。
　　結(jié)論:一次性大劑量腹腔注射STZ可制備有效、穩(wěn)定的1型糖尿病大鼠模型。首次建模失敗后，適時再次注射STZ仍可制備高質(zhì)量的1型糖尿病大鼠模型。胰島素治療可使1型糖尿病大鼠保持正常的血糖水平，在一定程度上對胰腺細胞產(chǎn)生治療作用。
　　第二部分:糖尿病大鼠Nfic與其它成骨相關(guān)基因表達的探究及胰島素的干預作用
　　目的：探究糖

10、尿病大鼠Nfic及成骨相關(guān)基因的表達變化及關(guān)系，研究胰島素對糖尿病大鼠骨代謝的干預作用。
　　方法：1型糖尿病大鼠模型制作同前，將大鼠分為3組，對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。觀察三組大鼠體重、血糖變化;8周后處死全部大鼠，胰腺組織進行HE染色及胰島素的免疫組化檢測;Q-PCR法檢測雙側(cè)股骨Runx2、Osterix(O

11、SX)、Nfic、COL2A1、OC(骨鈣素)、ALP、BMP-2、IGF-1(胰島素樣生長因子-1)的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，OC、IGF-1、Runx2、OSX基因mRNA表達中，模型組明顯低于對照組與治療組，治療組與對照組無顯著差異。COL2A1基因的mRNA表達中，模型組明顯低于對照組與治療組(p＜0.001，p＜0.01)，治療組的表達量顯著低于對照組(p＜0.05)。ALP基因的mRNA表達中

12、，模型組及治療組均顯著高于對照組(p＜0.01)，模型組較治療組偏低，但無顯著性差異(p＞0.05)。BMP-2、Nfic基因的mRNA表達中，模型組與治療組顯著低于對照組(p＜0.05，p＜0.05)。模型組與治療組之間無顯著性差異(p＞0.05)。
　　結(jié)論：在1型糖尿病大鼠模型中，骨組織Runx2、Nfic、OSX、BMP-2、IGF-1、OC、COL2A1 mRNA表達水平顯著下降，ALP mRNA表達水平顯著升高，胰島素

13、的應用可逆轉(zhuǎn)Runx2、OSX、IGF-1、OC、COL2A1 mRNA表達的下降，促進骨形成。
　　第三部分：糖尿病大鼠Nfic與成脂基因PPARγ的表達的變化及胰島素的干預作用
　　目的：研究糖尿病大鼠中Nfic、PPARγ基因mRNA的表達變化及胰島素對Nfic、PPARγ基因mRNA表達的干預作用。
　　方法：1型糖尿病大鼠模型制作同前，將大鼠分為3組，對照(正常)組(5只)、糖尿病模型組(10只)、胰島素治療

14、組(10只)。治療組于建模成功后第四天按(4-6U/kg/d)給予中效胰島素皮下注射。模型建成后8周處死全部大鼠， Q-PCR法檢測雙側(cè)股骨Nfic、PPARγ的mRNA表達水平。
　　結(jié)果：Q-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在Nfic基因的mRNA表達中，與對照組相比，模型組和治療組均顯著減少(p＜0.1)(p＜0.001);治療組與模型組相比，無顯著性差異。在PPARγ基因mRNA的表達中，與對照組相比，模型組和治療組均顯著增加(p＜0.0