DPV UL46基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)時相和主要抗原域表達(dá)、抗體制備和夾心ELISA檢測DPV研究.pdf

1、論文根據(jù)本實驗室鑒定的DPV UL46基因(GenBank登錄號EU195108)開展了如下系列研究：克隆UL46基因并對其分子特性進(jìn)行生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)、多克隆抗體的制備、轉(zhuǎn)錄時相及表達(dá)時相分析、DPV UL46蛋白屬性分析和基于UL46蛋白多克隆抗體檢測DPV抗原的雙抗體夾心ELISA法的建立等，獲得如下結(jié)果：
　　 1.DPV UL46基因的分子特性
　　 DPV UL46大小為2220bp，編碼739aa，

2、在20～500aa處存在一個Herpes_UL46結(jié)構(gòu)功能域，屬于皰疹病毒UL46蛋白家族，在17～470aa范圍內(nèi)存在大量的一致性序列，尤其是在356～413aa區(qū)段，顯示了高度的保守性。在單一氨基酸位點上，Gln372、Asn376、Tyr382和Trp385完全保守。 DPV UL46基因與24個皰疹病毒參考株UL46基因的氨基酸同源性均不高，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示其與α-皰疹病毒亞科中的MDV-2和GaHV-3等鳥類皰疹病毒的親緣關(guān)

3、系最近，與其他皰疹病毒關(guān)系較遠(yuǎn)，揭示DPV應(yīng)該被劃為α皰疹病毒亞科中單獨的一類。DPV UL46基因存在10個轉(zhuǎn)錄啟動子序列。UL46編碼蛋白共有35個抗原表位，分布于UL46多肽鏈的整個序列中，但主要位于氨基端Ser423～Thr449、Va1451～Ser500、Phe502～Tyr526、Asn540～Thr596、Glu614～Ala651、Ser655～Ser671、Gly681～Cys700區(qū)域。編碼的多肽鏈中親水區(qū)域大于疏

4、水區(qū)域，具有較好的親水性、可塑性和較高的抗原指數(shù)，無跨膜區(qū)域，是一種膜外蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)的核周區(qū)，無信號肽切割位點，成熟蛋白即為739aa，具有72個潛在的磷酸化位點，2個潛在的糖基化位點。密碼子偏嗜性分析表明DPV UL46基因?qū)幋a的氨基酸Trp、Met、His、Lys、Glu具有一定的偏嗜性。編碼蛋白的結(jié)構(gòu)多為柔性區(qū)域，富含α螺旋和β折疊，含少量無規(guī)則卷曲。同源模建分析，未發(fā)現(xiàn)與該蛋白相匹配的三級結(jié)構(gòu)。該分析結(jié)果對進(jìn)一步開展DP

5、V UL46基因生物學(xué)功能的研究具有一定的參考作用。考慮到DPV UL46基因序列較長，同時結(jié)合后續(xù)的應(yīng)用，根據(jù)抗原性和親水性等分析結(jié)果，確定編碼DPV UL46基因的主要抗原域的基因序列位于699～2220bp，將其命名為DPV UL46M。
　　 2.DPV UL46和DPV UL46M基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 根據(jù)DPV UL46基因序列(GenBank登錄號EU195108)分別設(shè)計兩對引物P

6、1/P2(含有BamHI和XhoI酶切位點，擴(kuò)增幅度為2558bp，含完整的DPV UL46基因)和P3/P4(針對UL46M基因，含有BamHI和XhoI酶切位點，擴(kuò)增幅度為1522bp)，PCR、雙酶切和測序結(jié)果均表明目的片段成功的得以克隆。通過對pMD18-T/UL46和pMD18-T/UL46M及pET-32a(+)進(jìn)行BamHI、XhoI雙酶切和連接，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(＋)/UL46和pET-32a(+)/UL

7、46M，并轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析表明主要抗原域區(qū)段得以順利表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，相對分子量約為79kD。優(yōu)化出最佳表達(dá)條件：IPTG濃度為0.2mmol/L，在E.coli Rosetta中37℃誘導(dǎo)4h。而DPV UL46完整基因表達(dá)失敗。用經(jīng)過鎳柱親和層析而獲得的較高純度的重組蛋白來免疫家兔以制備兔高免血清，Western blot方法顯示制備的多克隆抗

8、體能與融合蛋白特異性的結(jié)合，瓊擴(kuò)實驗顯示制備的多克隆抗血清效價達(dá)1:8?；谕每笵PV UL46M IgG的Dot-ELISA方法檢測DPV與其他毒/菌株，結(jié)果顯示，該抗體能與DPV特異性的結(jié)合，而與其他的毒/菌株均呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，這為進(jìn)一步深入研究UL46的功能奠定了基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步進(jìn)行表位疫苗開發(fā)和DPV分子診斷技術(shù)建立提供了科學(xué)材料。
　　 3.DPV UL46基因的轉(zhuǎn)錄時相和表達(dá)時相分析
　　 根據(jù)DPV UL

9、46基因和鴨β-actin內(nèi)參基因序列分別設(shè)計了目標(biāo)基因引物U3/U4(擴(kuò)增幅度為121bp)和內(nèi)參基因引物U1/U2(擴(kuò)增幅度為178bp)。在測定完UL46基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線后，提取感染DPV后的2h、4h、6h、8h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、66h、72h和80h不同時間段的DEF mRNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以cDNA為模板，SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

10、結(jié)果表明，UL46基因的轉(zhuǎn)錄在12h左右時開始增加，隨著時間的延長，轉(zhuǎn)錄量逐漸增加，在24h左右顯著增加并在54h左右達(dá)到峰值，此后表達(dá)量逐漸降低。收集感染DPV不同時間段的DEF，反復(fù)凍融3次裂解細(xì)胞并提取病毒蛋白，使用純化后的兔抗UL46M IgG通過Western blot對DPV感染的DEF中的UL46蛋白的表達(dá)時相進(jìn)行分析，結(jié)果顯示DPV UL46蛋白感染宿主細(xì)胞后12h可見約81.8kD的特異性條帶，隨時間推移表達(dá)量逐漸增多

11、，在60h左右達(dá)到最大值，符合晚期基因的表達(dá)譜特征，同時與ULA6基因的轉(zhuǎn)錄時相相符。轉(zhuǎn)錄時相和表達(dá)時相結(jié)果說明UL46基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)規(guī)律符合基因由轉(zhuǎn)錄到翻譯的生命周期規(guī)律，且具有先轉(zhuǎn)錄后表達(dá)的模式，也表明了DPV UL46基因是一個晚期基因。
　　 4.DPV UL46蛋白的屬性分析
　　 感染DPV后25h時收集DEF，低速離心并經(jīng)PBS清洗，NP-40破碎細(xì)胞后取上清和沉淀分別進(jìn)行Western blot，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

12、，能夠與兔抗DPV UL46M IgG特異性結(jié)合并出現(xiàn)大小與目的蛋白相符的條帶的是不溶于NP-40的沉淀部分，由此可以證實DPV VP11/12是DPV的結(jié)構(gòu)蛋白，是皮層的組成部分之一。
　　 5.雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用
　　 以純化的兔抗DPV UL46M IgG為第一抗體，純化的小鼠抗DPV IgG為夾心抗體，建立并優(yōu)化檢測DPV的雙抗體夾心ELISA方法。結(jié)果表明：最佳反應(yīng)條件為兔抗DPV UL4