鴨瘟病毒UL47基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析及主要抗原域的原核表達(dá)和抗體制備.pdf

1、對(duì)本實(shí)驗(yàn)室鑒定的鴨瘟病毒UL47基因(GenBank NO. EU195109)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。針對(duì)UL47全基因和UL47基因主要抗原域分別設(shè)計(jì)并合成特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定。原核表達(dá)并制備了UL47基因主要抗原域(UL47基因ORF的1417-2353bp)蛋白的多克隆抗體，對(duì)UL47進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄時(shí)相研究，獲得如下結(jié)果：
　　 1. DPV UL47基因序列特征分析
　　 DPV UL47基因的ORF為

2、2367bp，由788個(gè)氨基酸組成，分子量約為87.95kDa，等電點(diǎn)為6.23，親水、疏水氨基酸分別為227個(gè)和242個(gè)，各占28.8％和30.7％，酸性、堿性氨基酸分別為106個(gè)和121個(gè)，各占13.5％和15.3％。疏水性預(yù)測(cè)表明UL47蛋白疏水性最大值為2.6，最小值約為-3.8，疏水區(qū)主要位于369-370,393-406,490-493,510-516,526-528,622-630和641-648位氨基酸，親水區(qū)在多肽鏈占

3、據(jù)的位置明顯大于疏水區(qū)。該多肽有73個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，但無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)。亞細(xì)胞定位分析表明，UL47蛋白有69.6％分布于細(xì)胞核，13％分布于細(xì)胞膜，還有少量分布于線粒體、細(xì)胞漿和囊泡分泌系統(tǒng)中。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白以a-螺旋為主(40.36％),β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量較少，都為11.93％。
　　 2. DPV UL47基因密碼子偏愛(ài)性分析
　　 利用EMBOSS的CHIPS和CUSP

4、程序分析DPV UL47基因密碼子，結(jié)果表明其CAI、ENC值分別為0.71和52.40。由六種密碼子編碼的Arg, Ser和Leu，分別偏愛(ài)AGA,TCT和CTC，其Frequency(1/1000)高達(dá)24.081～31.686‰，而TCA、CTA的使用頻率為零。Val偏愛(ài)GTC, Ile偏愛(ài)ATC, Phe偏愛(ài)TTC, His偏愛(ài)CAT, Gln偏愛(ài)CAA，三個(gè)終止密碼子出現(xiàn)的頻率較高。DPV UL47基因整體密碼子的使用情況與其

5、他(大腸桿菌、酵母和人)的差值較小，不具有明顯偏差。另外，DPV UL47 G+C含量為44.99％，而第三位密碼子的G+C含量(即GC3s)就達(dá)51.58％，表明UL47在第三位密碼子上偏愛(ài)使用G或C。稀有密碼子分析表明DPV UL47基因有72個(gè)稀有密碼子，占總密碼子的3.04％，其中21個(gè)AGA,13個(gè)AGG和6個(gè)CGA為精氨酸稀有密碼子，12個(gè)CTA為亮氨酸稀有密碼子，6個(gè)ATA為異亮氨酸稀有密碼子，4個(gè)CCC為脯氨酸稀有密碼子

6、。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析表明DPV UL47更接近a皰疹病毒UL47基因，并且與GaHV-2, GaHV-3, MeHV-1和MDV-2等禽類(lèi)皰疹病毒的進(jìn)化關(guān)系最近，以上分析結(jié)果為開(kāi)展UL47基因功能研究具有一定的參考作用。
　　 3. DPV UL47基因主要抗原域的原核表達(dá)及抗體制備
　　 通過(guò)對(duì)UL47全基因和UL47基因主要抗原域分別設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及構(gòu)建T克隆和亞克隆重組質(zhì)粒，通過(guò)BamHI單酶切、BamH I

7、/XholI雙酶切、質(zhì)粒PCR及測(cè)序鑒定，成功將全基因及主要抗原域片段分別定向插入載體中，構(gòu)建了T克隆及亞克隆重組質(zhì)粒。IPTG誘導(dǎo)BL21進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明，UL47全基因未能表達(dá)，而UL47主要抗原域成功表達(dá)，蛋白大小為55kDa，符合理論值。表達(dá)形式分析表明UL47融合蛋白為包涵體，大量存在于超聲破碎后的沉淀中。經(jīng)過(guò)一系列表達(dá)條件優(yōu)化表明37℃下，加入0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6h, UL47主要抗原域蛋白表達(dá)量最大。利用純

8、化后的UL47主要抗原域蛋白制備兔抗UL47多克隆抗體，瓊擴(kuò)效價(jià)為1:16。免疫印跡結(jié)果顯示UL47主要抗原域蛋白能與兔抗DPV抗體和兔抗UL47抗體相互作用，表明該蛋白具有免疫原性。此外，根據(jù)UL47基因一段核苷酸片段設(shè)計(jì)5’端以地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針，然后應(yīng)用該探針對(duì)GPV、DHV、PRV、MDV、MDPV、ILTV、DPV以及UL47基因T克隆質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置未接毒的DEF核酸提取物為陰性對(duì)照，與實(shí)驗(yàn)組平行操作。試驗(yàn)結(jié)果為

9、UL47基因T克隆重組質(zhì)粒和DPV DNA顯示紫褐色，其余均不顯色，表明UL47基因確為DPV CHv UL47基因。
　　 4. UL47基因轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析
　　 根據(jù)內(nèi)參基因β-actin和鴨瘟病毒UL47基因的保守序列分別設(shè)計(jì)了熒光定量引物，收集感染鴨瘟病毒后1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h、24h、30h、36h、48h、54h、60h、72h等不同時(shí)間段的鴨胚成纖維細(xì)胞，采用T