蠶體內共生菌Wolbachia的檢測及對蠶卵子發(fā)育的影響.pdf

1、沃爾巴克氏體(Wolbachia)是存在于節(jié)肢動物體內的一類呈母系遺傳的細胞內共生細菌。該菌通過不同機制參與調控寄主的生殖活動，可誘導胞質不親和(CI)、孤雌生殖(PI)、雌性化、殺雄、增強雌性繁殖力等生殖現象。
　　 過去的幾年里，在Wolbachia菌的作用機理、種群生物學和進化方面做了比較多的研究，但主要集中在果蠅、蚊子和寄生蜂上。在鱗翅目中，關于Wolbachia的研究也有報道，蝴蝶和螟類中Wolbachia研究顯示Wo

2、lbachia具有不同的生殖調控作用。先前關于家蠶中的研究認為家蠶中沒有共生有Wolbachia菌。
　　 本研究在家蠶全基因組數據庫和Wolbachia基因組序列的基礎上，利用基因克隆、PCR、Southern雜交方法實驗證明了家蠶中Wolbachia的存在，分析了Wolbachia的系統(tǒng)進化及水平傳播；并通過抗生素消除Wolbachia實驗研究了Wolbachia對家蠶的調控作用，主要研究結果如下：
　　 1.家蠶和

3、野蠶體內Wolbachia特有基因的克隆及信息分析本實驗在不同地區(qū)的野蠶和不同品種家蠶個體總的基因組DNA中，均克隆獲得了Wolbachia兩個特異基因-wsp基因和ftsz基因。其中wsp基因片段長593 bp，編碼197個氨基酸，具有一個結構域，該結構編碼膜孔蛋白，介導微生物與宿主之間的關系。ftsz基因片段長571 bp，編碼189個氨基酸，具有兩個結構域，分別是微管蛋白和微管蛋白C末端結構域，參與細菌的分裂。使用PCR檢測方法，

4、結果發(fā)現在大造生殖組織和體細胞組織中均有分布，并且差異不大。另外通過在家蠶總RNA水平檢測wsp基因和ftsz基因的表達，結果沒有發(fā)現陽性條帶。
　　 2.Wolbachia的系統(tǒng)進化及水平傳播的分析Wolbachia能夠在不同的宿主間發(fā)生水平傳播現象，也正因為如此，使得Wolbachia在自然界中分布廣泛。本研究以ftsz和wsp基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示家蠶與野蠶的Wolbachia位于系統(tǒng)發(fā)育樹的B群，與寄生蜂類和鱗

5、翅目物種共生的Wolbachia關系最為接近。根據Wolbachia的水平傳播機制可以推測，野蠶體內的Wolbachia可能來自寄生蜂等膜翅目昆蟲，而野蠶體內的Wolbachia可能會通過捕食作用轉移到微小花蝽等蝽類體內。家蠶中的Wolbachia的來源可能有兩個途徑，一是野外采集桑葉上殘留的Wolbachia，二是來自野蠶體內?？紤]到Wolbachia母性傳播和家蠶馴養(yǎng)的過程，第二個可能性比較大。
　　 3.Wolbachia

6、基因水平轉移的分析為了研究Wolbachia的基因是否發(fā)生水平轉移，整合到家蠶或野蠶基因組中，首先以Wolbachia基因利用BLAST同源檢索家蠶基因組數據庫，結果顯示在家蠶基因組上沒有Wolbachia菌基因的同源序列，初步推測Wolbachia與家蠶之間沒有發(fā)生基因的水平轉移。進一步，利用wsp基因與蠶的基因組DNA進行Southern雜交試驗，在家蠶大造品種中，沒有檢測到任何條帶。表明Wolbachia與大造間沒有發(fā)生基因水平轉

7、移。在云南野蠶、西昌野蠶、湖州野蠶、云南野蠶與大造雜交后代基因組雜交出不同的條帶，顯示Wolbachia和這三個野蠶之間發(fā)生了wsp基因的水平轉移。
　　 4.Wolbachia對家蠶卵子發(fā)育的影響通過添食和注射實驗，應用不同濃度，不同抗生素處理不同時期的家蠶，四環(huán)素和環(huán)丙沙星能夠消除家蠶大造體內的Wolbachia，并且引起了家蠶卵子發(fā)育的異常，出現卵管短小，卵子個數明顯減少，卵管中卵子排列異常，解剖過程中很難分開；并且全部不

8、能化蛾。母代部分消除Wolbachia的個體，存活的F1代也出現卵子發(fā)育的異常，現象與處理的母代相同?？股靥幚淼男蹅€體與未處理雌個體交配，其F1代產卵和孵化率均正常，因此認為消除Wolbachia對雄個體的生殖發(fā)育沒有受到影響。為了進一步探索Wolbachia和宿主家蠶之間相互作用的分子機制，本研究檢測了與精巢和卵巢發(fā)育相關的基因，包括家蠶卵黃原蛋白基因BmVg、家蠶卵黃原蛋白受體基因BmVgR、兩性基因Bmdsx、精巢特異的β微管蛋