梅氏新貝尼登蟲組織蛋白酶b克隆和序列分析【文獻綜述】

1、<p><b>　　畢業(yè)論文文獻綜述</b></p><p><b>　　生物工程</b></p><p>　　梅氏新貝尼登蟲組織蛋白酶B克隆和序列分析</p><p>　　摘要：組織蛋白酶B（cathepsin B，CB）為半胱氨酸蛋白酶，具有廣譜的蛋白水解活性。本文就CB的生物學特性與生理功能及酶學性質，酶原

2、如何激活，CB與腫瘤擴散和細胞凋亡的關系以介紹，并對CB的抑制劑和應用方面的研究做了總結，最后總結了CB的基因結構特點及其表達調控機制。</p><p>　　關鍵詞：組織蛋白酶B；細胞凋亡；抑制劑；基因結構；表達調控</p><p>　　1 組織蛋白酶B簡介</p><p>　　組織蛋白酶B（cathepsin B，CB）為半胱氨酸蛋白酶，在酸性pH的溶酶體中，CB

3、主要是外肽酶，若在中性或堿性pH環(huán)境中，CB則為內肽酶（徐昌隆等，2004；李杰平等，2008）。CB的此種水解蛋白的雙重活性，使其蛋白水解范圍很廣。CB存在于細胞質和溶酶體中，其活性中心有巰基，可降解細胞外基質成分，進而破壞組織屏障(趙艷艷等，2008)。</p><p>　　CB廣泛存在于細菌、昆蟲和哺乳動物中。溶酶體的降解蛋白質過程中，CB發(fā)揮著重要的作用，血漿蛋白、激素和細菌等被溶酶體內的蛋白水解酶類水解

4、。CB對多種昆蟲，如棉鈴蟲、蚊等的卵黃磷蛋白水解活性高，提供胚胎發(fā)育必要的營養(yǎng)物質（杜欣軍等，2004）。</p><p><b>　　2 CB酶學性質</b></p><p>　　日本血吸蟲CB基因所編碼的蛋白分子量39.5kD，不含有亮氨酸。5—20位氨基酸區(qū)域可能為跨膜結構域，CB信號肽剪切位點在第26和27位氨基酸之間。蛋白序列中含有一個肽酶C1催化結構域，含

5、有半胱胺酸蛋白酶活性位點和磷酸化位點，因此推測此蛋白的活性可能會受磷酸化作用調節(jié)。研究海參CB酶學性質發(fā)現(xiàn)，CB最適溫度為40℃，最適pH為5.5（趙露露等，2008）。</p><p><b>　　3 CB酶原激活</b></p><p>　　無活性的前體酶原水解后變成成熟的組織蛋白酶，前體酶原由含有成熟酶活性中心的催化域和信號肽前體肽二者構成。信號肽負責將核糖體表

6、達的前體酶原蛋白轉運到內質網，然后在內質網被水解形成酶原。酶原通過蛋白水解，變?yōu)榉肿恿?0kDa的成熟單鏈形式，再作經進一步的裂解，最后才形成具有活性的成熟組織蛋白酶B。</p><p>　　溶酶體內的CB，首先在粗面內質網的核糖體內合成無活性酶原，到胞漿糖基化，糖基在高爾基體中被磷酸化修飾，形成甘露糖一6一磷酸蛋白，溶酶體上的6一磷酸甘露糖受體能對其進行識別，進而胞飲入溶酶體內。CB有兩種成熟形式，雙鏈的形式或

7、單鏈形式(楊麗等，2008)。</p><p>　　4 CB與腫瘤和細胞凋亡</p><p><b>　　4.1 CB與腫瘤</b></p><p>　　一方面，研究表明CB與瘤細胞的侵襲和轉移相關。exon2和exon3以及激活前體蛋白肽的7個氨基酸殘基在腫瘤時缺失，形成了特殊的mRNA產物，蛋白質合成后因其缺失信號肽，所以不能沿內質網途徑進

8、入溶酶體而彌散于胞漿中，在癌細胞轉移的過程中，CB可以直接溶解細胞外基質，產生可降解如層粘素、纖維連接蛋白等成分的酶，進而促進了腫瘤細胞向組織深部的浸潤（華靜等，2002）。瘤細胞分泌的CB不能被攝人的溶酶體，因其缺乏甘露糖一6一磷酸受體識別標記。利用免疫組化及原位雜交技術研究，發(fā)現(xiàn)CB在許多的種腫瘤細胞中表達較高（劉顧等，2008）。</p><p>　　另一方面來講，血管被CB通過多種機制促進形成，進而促使腫

9、瘤生長。CB降解基底膜和細胞外基質時，會從細胞外基質中釋放促血管生長因子，促進血管生成。另外，CB還可以降解金屬基質蛋白酶的抑制劑，直接或間接促進血管生成（肖慶等，2008；王中顯等，2006）。</p><p>　　4.2 CB與細胞凋亡</p><p>　　促凋亡蛋白Bid被CB裂解后，細胞色素C從線粒體被釋放，導致細胞凋亡的瀑布效應。這表明組織蛋白酶B與細胞凋亡存在著緊密的關系（李杰

10、平等，2007）。CB基因被剔除了的小鼠，對于TNF-α介導的肝細胞凋亡和肝損傷有阻斷作用。CB還參與了WEHI—S纖維肉瘤中TNF介導的細胞凋亡，這也同時說明了CB有截然相反的兩個作用：既可以促使瘤細胞對周圍組織的侵襲；也可以促進瘤細胞凋亡。</p><p>　　組織蛋白酶B有兩條途徑介導細胞凋亡：組織蛋白酶B不依賴于caspases的細胞凋亡途徑；組織蛋白酶B依賴于caspases的細胞凋亡途徑（李杰平等，2

11、007；王翠芬等，2008）。</p><p><b>　　5 CB抑制劑</b></p><p>　　人類的CB的抑制劑均屬于內源性的蛋白抑制劑，且專一性較差。惡性腫瘤中CB與CB抑制劑之間生理平衡的破壞，及CB抑制劑的表達下降，造成了CB活性的增加。腫瘤的侵襲和轉移過程，有CB同其抑制劑共同作用的參與。CB抑制劑有潛在治療和控制癌細胞轉移的作用，目前CB抑制劑已成

12、為研究抗腫瘤藥物的一個重要研究方向（肖慶等，2008）。</p><p>　　CB有三類主要的抑制劑：一類為kininogens，其對CB的抑制作用較弱；第二類為cystatins，主要包括cystatinC，cystainC是對CB親和力最大的蛋白；第三類為stefins，包括stefinC、stefinA和stefinB。</p><p>　　最近又發(fā)現(xiàn)了五種對組織蛋白酶B具有較好抑制

13、活性的黃烷醇類天然化合物抑制劑：proeyanidinB-2，prodelphinidinB-23'-O-gallate，(-)epigallocatechin-3-0-gallate，prodelphinidinB-2和puerinA，其IC50值分別為0.76，0.58，0.96，0.44和2.07μmol/L。這五種抑制劑是組織蛋白酶B的新型天然的抑制劑（賈銳銳等；2008）。</p><p>　　

14、大腸癌患者的cystatinC比正常時增加1.6倍，其抑制劑的含量雖增加，但增加的抑制劑并未平衡相應增加的組織蛋白酶B酶活性，即組織蛋白酶B和其抑制劑處于失平衡狀態(tài)。因此，可以將組織蛋白酶B的抑制劑與其比值用來作為斷定腫瘤惡性程度（喬鎮(zhèn)等，2008；劉頤等，1998）。</p><p><b>　　6 CB應用研究</b></p><p><b>　　6.1

15、 CB疫苗 </b></p><p>　　日本血吸蟲的CBDNA疫苗(Si31BIN)給小鼠接種后，結果顯示日本血吸蟲CBDNA疫苗具有高度的抗生殖免疫作用（易新元等，2000）。體外轉錄合成CB基因的特異性siRNA并轉染EC9706細胞，結果表明不同濃度的siRNA對CB及mRNA的表達都有抑制效應（婁欣等，2007）。進一步的研究表明，疫苗使小鼠獲得了抗血吸蟲感染的能力（田明禮等，2001）。因

16、此推測，Sj31B1N免疫后產生了細胞免疫，對血吸蟲的產卵和發(fā)育具有一定的影響，這給人類的抗寄生蟲感染帶來了新希望（曾憲忠等，2001）。</p><p>　　6.2 CB抑制劑的應用</p><p>　　巰基蛋白酶抑制劑在防治病蟲害上面，顯示了廣闊的應用前景。因為CB消化酶活性被抑制劑抑制，會引起昆蟲正常代謝的擾亂，甚至導致死亡。當前，已經克隆了水稻、玉米等l5種不同來源蛋白酶抑制劑的c

17、DNA，并轉入到不同植物中，其中大部對昆蟲有明顯抗性。CB抑制劑還有潛在的控制癌細胞轉移的作用，已成為研究抗寄生蟲感染、抗腫瘤疾病藥物的重要研究方向。</p><p>　　6.3 CB在食品工業(yè)中的應用</p><p>　　CB在食品工業(yè)中具有重要的應用價值。CB能將肌肉中的蛋白質分解成游離氨基酸和多肽，進而降解成風味成份——醛類和酮類化合物。CB能降解原肌蛋白、肌球蛋白等蛋白，在肉加工時

18、的嫩化、成熟中發(fā)揮重要作用（趙改名等，2003）。</p><p>　　7 CB基因結構特點</p><p>　　CB基因的核苷酸有一定的保守性，不同種動物及不同組織的CB序列具有相似的結構與組成。日本血吸蟲CB基因序列與曼氏血吸蟲CB肽鏈內切酶基因序列高度同源(85％的同一性)，編碼348個氨基酸（胡永軒等，2004）。</p><p>　　鼠的CB基因由10個外

19、顯子(exon)和9個內含子(intron)組成，催化活性位點被內含子分開，5′端具有TATA盒和信號肽。禽的CB基因共編碼340個氨基酸，與鼠的CB序列很相似（Dong等，2004）。</p><p>　　8 CB基因表達調控機制</p><p>　　CB表達的調節(jié)，存在著基因、轉錄和轉錄后水平，以及翻譯、翻譯后修飾等多水平的調節(jié)（李美寧，2005）。轉錄因子，如Ets1、CBBP和Sp

20、1等均在轉錄過程中起重要作用。視黃酸、鈣化醇等，在轉錄和轉錄后水平都起著調控CB表達的作用（Isabelle M. Berquin等，1999）。另外，mRNA異常的表達也可以致使CB的外泄，在轉錄、轉錄后加工、翻譯等過程中，都能影響到CB的活力。反義RNA技術可對蛋白質進行負調控(盧士英等，2004)。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>

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