梅氏新貝尼登蟲(chóng)mucin基因異構(gòu)體的鑒定【開(kāi)題報(bào)告+文獻(xiàn)綜述+畢業(yè)設(shè)計(jì)】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)論文系列</b></p><p><b>　　開(kāi)題報(bào)告</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p><p>　　梅氏新貝尼登蟲(chóng)Mucin基因異構(gòu)體的鑒定</p><p>　　一、選題的背景與意義</p>&l

2、t;p>　　梅氏新貝尼登蟲(chóng)(Neobenedenia melleni)是世界上廣泛分布的一類寄生蟲(chóng)，在許多種類的海水養(yǎng)殖魚(yú)類體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)，它們主要寄生在魚(yú)類體表、鰓絲和鰭等部位，其分類位置為單殖目、分室科、新貝尼登蟲(chóng)屬。寄生蟲(chóng)通過(guò)識(shí)別宿主體表分泌的黏液侵染宿主，以宿主體內(nèi)血液或體表某些組織為食。受到感染的魚(yú)體通過(guò)摩擦養(yǎng)殖網(wǎng)箱以制止皮膚搔癢，進(jìn)而使自身皮膚大面積受傷糜爛，鱗片脫落，最終導(dǎo)致病魚(yú)精神不定，拒食而亡(楊文川等, 2001

3、;Leong, et al, 2002;黃艷平等, 2003)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱，梅氏新貝尼登蟲(chóng)病害經(jīng)常在我國(guó)沿海地區(qū)爆發(fā)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失，養(yǎng)殖魚(yú)類感染此寄生蟲(chóng)的數(shù)目已占一半以上，在某些地區(qū)甚至已達(dá)100％(楊文川等, 2004)。由此可見(jiàn)，對(duì)此類寄生蟲(chóng)的防治已迫在眉睫。</p><p>　　目前針對(duì)梅氏新貝尼登蟲(chóng)的防治方法主要有 三：①淡水加 20 ×10-6氟本

4、尼考等抗菌素浸洗 5～10min，絕大部分蟲(chóng)體變白脫落死亡，這也是本尼登蟲(chóng)病最安全、有效的防治方法，但缺點(diǎn)是操作繁瑣、勞動(dòng)強(qiáng)度較大； ②250×10-6福爾馬林海水增氧浸洗 20min； ③用生石灰等潑灑或掛袋亦可防治。這些方法雖有一定療效，但很難從根本上制止梅氏新貝尼登蟲(chóng)對(duì)魚(yú)類的侵害，尤其是難以殺死蟲(chóng)卵，使疾病屢治屢發(fā)。深入研究梅氏新貝尼登蟲(chóng)寄生過(guò)程的分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)針對(duì)關(guān)鍵蛋白的抗體藥

5、物成為控制此種疾病的關(guān)鍵。</p><p>　　Mucin基因是生命體廣泛表達(dá)的一類基因，其編碼的黏蛋白是一類高度糖基化蛋白（H</p><p>　　ward and Carolyn, 2005），集中分布在呼吸道和消化道等組織的粘膜表面，行使?jié)櫥氨Ｗo(hù)的作用。蛋白骨架核心區(qū)域絲氨酸、蘇氨酸殘基上連接的大量寡糖鏈構(gòu)成黏蛋白的基本結(jié)構(gòu)，其中總分子量的一半以上由這些寡糖鏈占據(jù)。?？茖W(xué)家對(duì)梅氏新

6、貝尼登蟲(chóng)和魚(yú)類體表分泌的黏液成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其中都含有Mucin基因家族編碼的黏蛋白，Emmanuel Roger等研究證明它們?cè)诩闹鞯淖R(shí)別與入侵以及宿主的免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用(Emmanuel and Benjamin, 2008)。</p><p>　　目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Mucin基因的研究才剛剛起步，國(guó)外對(duì)Mucin基因及其蛋白已經(jīng)作了大量研究。初步對(duì)Mucin基因序列的分析與比對(duì)證明，這類基因是由可變數(shù)目

7、的重復(fù)序列組成(VNTA variable number of tandem repeats，VNTRs)，因此具有多種異構(gòu)體。其所編碼的黏蛋白在核心蛋白部位具有相應(yīng)的特異性連續(xù)重復(fù)模體(tandem repeats，TRs)結(jié)構(gòu)，它們也因此具有多態(tài)性（高峰等, 2007）。推測(cè)這種多態(tài)性與寄主和宿主進(jìn)化過(guò)程中的雙向選擇具有密切關(guān)系（Georgios, et al , 2001）。</p><p>　　本課題對(duì)梅

8、氏新貝尼登蟲(chóng)的RNA進(jìn)行提取以獲得其Mucin基因的異構(gòu)體cDNA序列，通過(guò)分析與比對(duì)來(lái)鑒定此基因的分子特征，為進(jìn)一步探究梅氏新貝尼登蟲(chóng)寄生過(guò)程中Mucin基因發(fā)揮的作用和尋找防治此種病原蟲(chóng)疾病的新方法提供理論依據(jù)。</p><p>　　二、研究的基本內(nèi)容與擬解決的主要問(wèn)題：</p><p><b>　　研究的基本內(nèi)容：</b></p><p>

9、;　　本實(shí)驗(yàn)主要是從梅氏新貝尼登蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中獲得Mucin基因異構(gòu)體 cDNA全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行序列分析比對(duì)及糖基化分析，最后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析梅氏新貝尼登蟲(chóng)不同發(fā)育階段Mucin基因的表達(dá)情況。</p><p><b>　　擬解決的問(wèn)題：</b></p><p>　　梅氏新貝尼登蟲(chóng)Mucin基因異構(gòu)體分子特征鑒定。</p><p>

10、　　三、研究的方法與技術(shù)路線：</p><p><b>　　（一）研究方法</b></p><p><b>　　1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物</b></p><p>　　2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省寧波市象山黃避岙港灣水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗中心養(yǎng)殖的大黃魚(yú)(Pseudosciaena crocea)體表分離梅氏新貝尼登蟲(chóng)成蟲(chóng)，經(jīng)系統(tǒng)寄

11、生蟲(chóng)學(xué)的鑒定，暫養(yǎng)于海水中至腸道內(nèi)含物排空后，用無(wú)菌雙蒸水反復(fù)沖洗蟲(chóng)體后置于Eppendoff管中，-70 C冰箱保存?zhèn)溆谩?lt;/p><p><b>　　2.總RNA提取</b></p><p>　　利用RNAiso試劑提取健康香魚(yú)肝臟組織總RNA：</p><p>　　(1)將100 mg -70℃保存的樣品在液氮中研磨成粉末，然后加入1 m

12、l RNAiso組織(以下為加入1 ml Trizol試劑標(biāo)準(zhǔn))。</p><p>　　(2)研磨后轉(zhuǎn)入1.5 ml Eppendorf管中，劇烈振蕩混勻，室溫放置5 min。4 ℃， 12 000rpm離心5 min。</p><p>　　(3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5體積氯仿，用力振蕩15 s，充分混勻，室溫放置2-3 min。4 ℃， 12 000 rpm離心10 min

13、。</p><p>　　(4)底層為氯仿相，中層為蛋白相，上層是含RNA的無(wú)色水相。將上清轉(zhuǎn)入一新的離心管(注意不要吸入蛋白層)，加入0.5 ml氯仿于上清，振蕩混勻，室溫放置2-3 min。4 ℃，12 000 rpm離心10 min。</p><p>　　(5)將上清轉(zhuǎn)入一新的離心管，加入與上清等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置10 min。4 ℃ 12 000 rpm離心10 min

14、，去上清。</p><p>　　(6)加入DEPC水配制的體積分?jǐn)?shù)75 ％乙醇1 ml，振搖，洗滌沉淀。4 ℃ 12 000 rpm離心5 min。重復(fù)步驟(6)一次，以徹底將鹽份除凈。</p><p>　　(7)去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意：所有待用的非Tris的試劑用0.1 % DEPC水溶液配制。離心管、槍頭、研缽及玻璃器皿等用0.1 % DEPC水處理過(guò)夜后121 ℃高

15、壓滅菌20 min。提取過(guò)程中要勤換手套及戴口罩，以免RNA降解。</p><p>　　(8)RNA樣品OD值檢測(cè)。取1 μl RNA溶液加入到69 μl DEPC處理水中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定230 nm、260 nm和280 nm的OD值。</p><p>　　RNA濃度＝OD260×核酸稀釋倍數(shù)×40/1000(μg/μl)</p><p>

16、;　　去除蛋白指標(biāo)：OD260/OD280≥1.8</p><p>　　去除鹽分指標(biāo)：OD260/OD230≥2.0</p><p>　　(9)RNA電泳檢測(cè)。取5 μl RNA樣品加4 μl DEPC處理水和1 μl 10×Buffer凝膠電泳上樣緩沖液，混勻后上樣，進(jìn)行電泳。</p><p>　　(10)mRNA純化采用Oligotex-dT30<

17、;Super>進(jìn)行純化。</p><p>　　3. 構(gòu)建寄生蟲(chóng)cDNA文庫(kù)構(gòu)建</p><p>　　實(shí)驗(yàn)采用的載體為pBluescript II SK (+)，根據(jù)選擇的EcoRI和XhoI酶切位點(diǎn)和錨定引物。</p><p>　　3.1 cDNA第一鏈的合成</p><p>　?。?）模板RNA（Poly(A)+ RNA）5 .00

18、μg中加入不含RNA酶的滅菌水，使其總量達(dá)到10.8μl。</p><p>　?。?）65℃加熱5min后，冰中放置5min（冷卻)。</p><p>　　（3）在微量離心管中配制下列反應(yīng)液。</p><p>　?。?）向(3)的反應(yīng)液里加入2的熱處理后的Poly(A)+ RNA溶液（5μg），輕輕混勻。</p><p>　?。?）室溫放置1

19、0min后，加入Reverse Transcriptae（M-MLV)1.0μl（全量為20μl)，輕輕混勻。</p><p>　?。?）42℃反應(yīng)1h。</p><p>　　（7）反應(yīng)結(jié)束后置于冰中冷卻2min。</p><p>　　3.2 cDNA第二鏈的合成</p><p>　　（1）在cDNA第一鏈合成液（20μl）中按下列順序加入反

20、應(yīng)試劑，進(jìn)行2nd Strand cDNA的合成反應(yīng)（反應(yīng)液總量為146μl)。</p><p>　?。?）用移液槍輕輕混勻后16℃反應(yīng)2h。</p><p>　　（3）70℃加熱10min后，室溫放置5min。</p><p>　　（4）加入4μl的T4 DNA Polymerase后，輕輕攪拌。</p><p>　?。?）37℃反應(yīng)10m

21、in。</p><p>　?。?）向2nd Strand cDNA合成反應(yīng)液（150μl）中加入等量（150μl）的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）溶液。Vortex攪拌5～10s。</p><p>　?。?）室溫下15,000 rpm離心5min，液體分為二層。小心取出水相（上層）移至另一個(gè)新的微量離心管中(注意切勿取出中間層)。</p><p>　?。?）向

22、水相中加入等量（150μl）的氯仿/異戊醇（24：1）溶液，Vortex攪拌5～10s。</p><p>　　（9）在室溫下15,000 rpm離心5min，液體分為二層。小心取出水相（上層）移至另一個(gè)新的微量離心管中。</p><p>　?。?0）加入1/10量（15μl）的3 M Sodium Acetate、4μl 的Dr. GenTLE Precipitation Carrier、

23、2～2.5倍量的100%乙醇。</p><p>　?。?1）均勻混合后立即進(jìn)行15,000 rpm、30min的離心(室溫下)。</p><p>　　（12）除去上清后用70%的乙醇清洗。</p><p>　　（13）干燥沉淀后，用12.5μl的不含RNA酶的滅菌水溶解沉淀。</p><p>　　3.3 接頭連接(Adaptor Ligati

24、on)</p><p>　　向上述雙鏈cDNA溶液12.5μl中加入下列試劑，全量20μl。</p><p>　　(2) 輕輕混勻后，8℃過(guò)夜反應(yīng)（16h以上)。</p><p>　　(3) 70℃保溫30min后，室溫放置5min。</p><p>　　(4) 4℃下12000g離心15min，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4℃下1

25、2000g離心5min。</p><p>　　3.4 限制酶Xho I 酶切反應(yīng)</p><p>　　(1) 向Adaptor Ligation溶液20μl中加入下列試劑，全量50μl。</p><p>　　輕輕混勻后，37℃反應(yīng)3h。</p><p>　　3.5 使用Spin Column除去短鏈cDNA</p><p&

26、gt;　　以下的Column處理可以除去400 bp以下的短鏈cDNA。Spin Column的準(zhǔn)備:</p><p>　?。?）反復(fù)上下顛倒懸濁Column內(nèi)的Gel。</p><p>　?。?）先取下上蓋后，慢慢取下下蓋，Column上下蓋不要丟棄。</p><p>　?。?）讓Column內(nèi)的Buffer自然流出（大約需要15min)。</p>

27、<p>　?。?）安裝下蓋，向Column中加入2 ml的TE Buffer后再蓋上蓋，反復(fù)上下顛倒懸濁Gel。</p><p>　?。?）重復(fù)上述操作(2)～(4)。</p><p>　?。?）取下Column的上下蓋，讓Column內(nèi)的Buffer自然流出。</p><p>　?。?）將去蓋的1.5 ml Microtube放置于FALCON Tube

28、中，然后將Spin Column插入FALCON Tube中，將Column的下端安裝于FALCON Tube中的1.5 ml Microtube內(nèi)×2，400 g離心2min。</p><p>　?。?）丟棄FALCON Tube中的1.5 ml Microtube，向FALCON Tube中放入新的去蓋的1.5 ml Microtube，再將Spin Column的下端安裝于FALCON Tube中

29、的1.5 ml Microtube內(nèi)。</p><p>　?。?）向Xho I 酶切溶液（50μl）中加入下列試劑，充分混合。</p><p>　　（10）將上述(1)的溶液向操作1中準(zhǔn)備好的Spin Column中添加。請(qǐng)注意要添加在Column中的Gel表面的中央位置，每次添加約10μl，分?jǐn)?shù)次慢慢添加。</p><p>　?。?1）400 g離心2min。&l

30、t;/p><p>　?。?2）Column洗脫液約100μl轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml Microtube中，加入等量（100μl）的苯酚/氯仿/異戊醇（25：24 ：1）溶液，劇烈振蕩混勻。</p><p>　?。?3）室溫下15,000 rpm離心5min，液體分為二層，小心取出水相（上層）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的微量離心管中(注意切勿取出中間層)。</p><p>　　（14

31、）加入等量（100μl）的氯仿/異戊醇（24 ：1）溶液，劇烈振蕩混勻。</p><p>　?。?5）室溫下15,000 rpm離心5min，液體分為二層，小心取出水相（上層）轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的微量離心管中。</p><p>　?。?6）加入1/10量（10μl）的Sodium Acetate、4μl 的Precipitation Carrier，2～2.5倍量的100%乙醇，充分混勻。&l

32、t;/p><p>　?。?7）室溫下15,000 rpm離心30min，除去上清，再用70%乙醇清洗沉淀。</p><p>　?。?8）干燥沉淀后用15μl的RNase-free H2O溶解沉淀。</p><p>　　3.6連接到特定質(zhì)粒載體</p><p><b>　　載體結(jié)合反應(yīng)</b></p><p

33、>　　配制下列Ligation反應(yīng)液。</p><p>　?。?）輕輕混合后12℃過(guò)夜反應(yīng)。</p><p>　?。?）向Ligation反應(yīng)液中加入80μl的TE Buffer，用等量(100μl）的苯酚/氯仿/異戊醇（25 ：24 ：1）抽提1次，再用等量（100μl）的氯仿/異戊醇（24 ：1)抽提1次。</p><p>　?。?）向上清中加入1/10量

34、（10μl）的3 M Sodium Acetate(pH5.2）、4μl的Dr.GenTLE Precipitation Carrier，2～2.5倍量的100%乙醇，充分混合。</p><p>　　（5）室溫15,000 rpm離心30min，除去上清。</p><p>　?。?）用70%乙醇清洗沉淀。</p><p>　?。?）干燥沉淀后，用20μl 的TE B

35、uffer溶解沉淀。</p><p>　?。?）-20℃保存。</p><p><b>　　3.7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化</b></p><p>　?。?）將-80℃保存的DH10B Electro-Cells于冰上融解。</p><p>　?。?）將Ligation溶液的一部分（0.5～1.0μl）加入至DH10B Electro-

36、Cells中，輕輕混勻。</p><p>　?。?）將(2)的菌液迅速轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的0.1 cm沖擊槽中，施加電壓脈沖進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。</p><p>　?。?）向沖擊槽內(nèi)快速加入冰上預(yù)冷的SOC。</p><p>　　（5）全量取出回收后，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)Tube中（FALCONTube等)，37℃振蕩培養(yǎng)1h（使用1 ml的SOC培養(yǎng)基)。</p>&l

37、t;p>　?。?）取部分5的培養(yǎng)液（1μl或10μl）涂布于LB/Amp瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，剩余的培養(yǎng)液請(qǐng)于4℃保存。</p><p>　?。?）37℃過(guò)夜培養(yǎng)。</p><p>　?。?）計(jì)算菌落數(shù)，求取cDNA Primary-Library效率。</p><p>　?。?）使用T7 Promoter Primer及T3 Promoter Primer

38、進(jìn)行Colony PCR反應(yīng)，確認(rèn)本Library的Insert分布情況。</p><p>　　4 PCR擴(kuò)增、RACE及熒光定量PCR檢測(cè)</p><p>　　設(shè)計(jì)兼并引物，獲取Mucin基因異構(gòu)體全長(zhǎng)序列，若基因未獲全長(zhǎng)，可根據(jù)已獲得的序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行末端擴(kuò)增，從而獲得Mucin異構(gòu)體的全長(zhǎng)序列序列測(cè)定和分析采用ABI PRISMTM 3770 DNA自動(dòng)測(cè)序儀雙向測(cè)序，由華大基

39、因公司測(cè)定。序列分析采用BLASTP分析軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov /BLAST/)，多重序列比對(duì)采用DNAMAN軟件，糖基化分析采用ExPASy軟件(http://www.expasy.ch/)，梅氏新貝尼登蟲(chóng)不同發(fā)育階段Mucin基因的表達(dá)情況由實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析完成。</p><p><b>　　（二）技術(shù)路線</b></p><

40、;p>　　四、研究的總體安排與進(jìn)度</p><p>　　2010.9-2010.10 畢業(yè)論文選題</p><p>　　2010.10-2010.11 進(jìn)行文獻(xiàn)查閱和資料收集，.完成開(kāi)題報(bào)告及任務(wù)書(shū)，制定具體研究計(jì)劃和試驗(yàn)方案。</p><p>　　2010.11-2011.1 獲得梅氏新貝尼登蟲(chóng)Mucin基因異構(gòu)體全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)其進(jìn)行BLAST分析，

41、比對(duì)分析和Mucin基因異構(gòu)體進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建</p><p>　　2011.1-2011.2 數(shù)據(jù)和材料整理、分析。</p><p>　　2011.2-2011.3 開(kāi)題答辯與綜述。</p><p>　　2011.3-2011.5 完成2篇外文翻譯，論文撰寫(xiě)、提交并答辯。</p><p><b>　　五、主要參考文獻(xiàn)：</b

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67、ucins in the host defence against Naegleria fowleri and mucinolytic activity as a possible meansof evasion [J]. Microbiology2008, 154(1): 3895-3904</p><p>　　[35] Georgios T, Sally J, Hicks, et a1. The role o

68、f mucins in host–parasite interactions: Part II-helminth parasites[J]. TRENDS in Parasitology, 2001, 17(3): 130-135</p><p><b>　　畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述</b></p><p><b>　　生物技術(shù)</b></p>

69、;<p>　　Mucin基因的研究進(jìn)展</p><p>　　摘要：Mucin基因是一類產(chǎn)物為黏蛋白的基因，分布廣泛，調(diào)控多種生命活動(dòng)。本文對(duì)Mucin基因和蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能做了簡(jiǎn)要的介紹，同時(shí)探討了Mucin基因的研究在疾病尤其是癌癥防治領(lǐng)域的重要意義。最后，本文介紹了Mucin基因研究的現(xiàn)狀與最新進(jìn)展。</p><p>　　關(guān)鍵詞：Mucin 基因 黏蛋白 多態(tài)性 疾病防

70、治</p><p><b>　　引言</b></p><p>　　動(dòng)物，植物乃至微生物在生長(zhǎng)發(fā)育和代謝過(guò)程中，普遍合成和分泌成分各不相同的黏液狀物質(zhì)，用于防御病原體的入侵，保護(hù)組織器官，適應(yīng)外界環(huán)境，完成寄生繁殖等生命活動(dòng)。經(jīng)過(guò)研究，這些黏液狀物質(zhì)都含一類結(jié)構(gòu)和功能相近的蛋白質(zhì)，人們稱之為 “Mucin”，即黏蛋白。大量的實(shí)驗(yàn)證明這類蛋白在生命活動(dòng)中起著重要的作用，而

71、人們對(duì)它的了解還十分有限。從對(duì)Mucin 基因的研究入手，深入了解其結(jié)構(gòu)特征，表達(dá)與調(diào)控機(jī)制，對(duì)認(rèn)識(shí)此類蛋白結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)它的利用乃至各種疾病的治療具有重要意義。</p><p>　　1 Mucin基因概述</p><p>　　1.1 Mucin基因及蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)特征</p><p>　　Mucin基因家族是科學(xué)家研究較多的一類基因，目前已確認(rèn)了十一種粘蛋白

72、。此類人類黏蛋白基因表達(dá)復(fù)合的RNA，是可變數(shù)目的重復(fù)模體組成的(Alex L, et al, 2000)，在可變重復(fù)模體編碼的氨基酸中大量聚集著絲氨酸和蘇氨酸（高峰等, 2007）。黏蛋白是一類高度糖基化蛋白（Howard and Carolyn, 2005），集中分布在呼吸道和消化道等組織的粘膜表面，行使?jié)櫥氨Ｗo(hù)的作用。蛋白骨架核心區(qū)域絲氨酸、蘇氨酸殘基上連接的大量寡糖鏈構(gòu)成黏蛋白的基本結(jié)構(gòu)，其中總分子量的一半以上由這些寡糖鏈占據(jù)

73、。這些糖鏈大部分是0一連接糖鏈，在機(jī)體非特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不可忽視的作用。蛋白的核心部位具有不同的連續(xù)重復(fù)模體并分為分泌型和膜結(jié)合型兩種類型。前者具有膜錨定序列，后者缺少此序列，但兩種類型序列N端都含有信號(hào)肽(Henrik, et a1, 1997; Julenius, et a1, 2005）。</p><p>　　1.2 幾種重要Mucin 基因的介紹</p><p>　　目前，科

74、學(xué)家確認(rèn)的十一種粘蛋白標(biāo)記為：muc1-4、muc5AC、muc5B、muc6-8、muc11-12（康美和等, 2008）?，F(xiàn)選擇幾種較為常見(jiàn)的做簡(jiǎn)要介紹。MUC1基因是最為常見(jiàn)的人體Mucin基因，其長(zhǎng)度約1821bp，串聯(lián)重復(fù)序列位于MUC1基因第2個(gè)外顯子，序列特征符合典型的小衛(wèi)星序列。人類MUC1基因具有多個(gè)異構(gòu)體，而其它物種此基因沒(méi)有這樣的多態(tài)性（高峰等, 2007）。MUC7基因長(zhǎng)度為11kb左右，其蛋白產(chǎn)物是一條單獨(dú)的肽

75、鏈，由五個(gè)結(jié)構(gòu)域組成 (Soares, 2002)。Muc2基因是從人類小腸正常杯狀細(xì)胞所特有的cDNA文庫(kù)中克隆到的一種基因，其編碼的蛋白產(chǎn)物是小腸粘液中不可缺少的組成成分（翁羽蕙等, 2010）。Muc6基因是從人類胃cDNA文庫(kù)中所克隆到的一種基因，它的核心區(qū)域由可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列組成，此區(qū)域可編碼160個(gè)氨基酸殘基（汪榮泉等, 2001）。MUC16基因由84個(gè)外顯子組成，基因長(zhǎng)度在100kb以上，約編碼156個(gè)氨基酸殘基（

76、王超等, 2009）。這些基因都具有Mucin基因家族共有的序列特征。</p><p>　　2 Mucin基因的研究與疾病的防治</p><p>　　Mucin基因蛋白廣泛分布于機(jī)體多種器官和組織的黏膜表面，如消化道、呼吸道、生殖道、角結(jié)膜等。它們有些是膜蛋白，有些是分泌蛋白，起到細(xì)胞識(shí)別與信號(hào)傳遞的作用。這就決定了此類蛋白與細(xì)胞癌變、免疫、生物寄生等生命現(xiàn)象的密切關(guān)系。深入研究Mucin

77、基因?qū)θ藗兞私飧鞣N疾病的致病機(jī)理與防治具有重要意義。</p><p>　　2.1 Mucin基因與癌癥治療 </p><p>　　大量實(shí)驗(yàn)證明Mucin基因與癌癥有密切關(guān)系，且不同的Mucin基因與癌癥關(guān)系各不相同。馮美燕等研究發(fā)現(xiàn)MUC1在正常胃癌演進(jìn)的過(guò)程中，表達(dá)率呈下調(diào)趨勢(shì)，而MUC2在此過(guò)程中為上調(diào)表達(dá)（馮美燕等, 2002）。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道稱，肺癌患者手術(shù)后的平均生存時(shí)間和肺癌組織

78、中MUC1基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)量成反比，MUC1基因陽(yáng)蛋白產(chǎn)物表達(dá)量越高，肺癌患者接受手術(shù)后的壽命越短（康美和, 2008）。汪榮泉等在研究中發(fā)現(xiàn)，胃粘膜表面成分中含有MUC6基因編碼的蛋白產(chǎn)物，胃癌患者患病后和患病前相比，MUC6基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)量明顯下降（汪榮泉等, 2001）；科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，胃粘膜表面成分中同樣含有MUC5AC基因編碼的蛋白產(chǎn)物，相對(duì)于正常細(xì)胞而言，此蛋白在癌變細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下調(diào)（汪榮泉等, 1999）。曹紅等

79、在研究中發(fā)現(xiàn)，與正常細(xì)胞相比，結(jié)石性膽囊炎和膽囊腺瘤樣息肉病變部位的細(xì)胞中MUC1和MUC3基因蛋白產(chǎn)物的表達(dá)量大大減少，這為結(jié)石病和膽囊癌的病前診斷提供了新的思路（曹紅等, 2003）。</p><p>　　2.2 Mucin基因在其他疾病中作用的研究</p><p>　　劉劍波等研究發(fā)現(xiàn)，人以及動(dòng)物體內(nèi)的支氣管壁表面分泌的粘液中含有大量Mucin基因編碼的蛋白產(chǎn)物，而哮喘患者呼吸不暢是

80、因支氣管粘膜分泌了大量黏液堵塞氣道引起，由此推測(cè)減少M(fèi)uin基因的表達(dá)量可有效降低氣喘病的發(fā)病率。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)Mucin基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)量上調(diào)可導(dǎo)致哮喘?。▌Σ? 2004）。杜立陽(yáng)等研究發(fā)現(xiàn)，人體腸道粘膜表面的粘液中集中分布著大量粘蛋白，其中MUC2基因編碼的蛋白產(chǎn)物含量最多。粘液成分是腸黏膜重要化學(xué)屏障，腸道炎癥的發(fā)生大多源于粘液成分的損傷。MUC2基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)量的異常會(huì)導(dǎo)致粘液層受到破壞，調(diào)整粘蛋白表達(dá)量通常是治療此類疾

81、病的關(guān)鍵（杜立陽(yáng)等, 2010）。黃雪琨等在研究中發(fā)現(xiàn)，人類鼻竇粘膜表面含有大量以MUC2基因蛋白產(chǎn)物為主的粘蛋白，鼻竇炎患者炎癥區(qū)域黏液過(guò)度分泌，這是由于細(xì)胞中MUC2基因的表達(dá)量顯著上調(diào)引起(黃雪琨等, 2007)。黎國(guó)偉等通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了急性白血病患者M(jìn)UCl基因的表達(dá)情況及臨床意義，發(fā)現(xiàn)與健康人相比，患者M(jìn)UCl基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)量顯著異常，這可作為分子生物學(xué)指標(biāo)診斷急性白血病患者（黎國(guó)偉等, 2005）。</p>&

82、lt;p>　　3 Mucin基因在寄主向宿主侵襲過(guò)程中所起的重要作用的探究</p><p>　　目前，國(guó)內(nèi)對(duì)Mucin基因的研究才剛剛起步，而且僅限于人體Mucin基因的研究和相關(guān)疾病的治愈，對(duì)其它動(dòng)物體內(nèi)的Mucin基因研究甚少。然而，國(guó)外對(duì)Mucin基因及其蛋白作了大量研究，研究范圍已經(jīng)從脊椎動(dòng)物延伸到無(wú)脊椎動(dòng)物。在研究過(guò)程中，Mucin基因在寄主向宿主侵襲過(guò)程中所起的重要作用成為一個(gè)新的重要發(fā)現(xiàn)（Is

83、aac and Jose´ de Jesu´ s, 2008）。</p><p>　　寄主和宿主在漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中是相互選擇，互相促進(jìn)的。很多寄主是依靠自身分泌的一類黏液物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主的識(shí)別和寄生部位的確定。這類黏液含有多種蛋白質(zhì)，其中有一類蛋白質(zhì)在侵襲寄主過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用(Alvaro, et a1, 2001)，它們接觸到宿主細(xì)胞表面后能與細(xì)胞膜上的受體特異性結(jié)合，甚至水解某些宿主的

84、結(jié)構(gòu)和功能蛋白，幫助寄主識(shí)別并入侵宿主體內(nèi)。與此同時(shí)，宿主自身也分泌類似的含有多種蛋白的黏液物質(zhì)，其中有一類蛋白同樣具有識(shí)別和消化的作用，所不同的是，有時(shí)候這類蛋白會(huì)成為宿主識(shí)別寄主的靶位點(diǎn)或者成為寄主維持生存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Georgios, et a1, 2001)。研究發(fā)現(xiàn)，寄主和宿主具有的這類蛋白有共同的結(jié)構(gòu)特征和高度的多態(tài)性。Emmanuel Roger等對(duì)其基因序列分析比對(duì)后初步認(rèn)定此類基因?qū)儆贛ucin基因家族（Emmanue

85、l and Benjamin, 2008）。</p><p>　　寄主和宿主體內(nèi)的Mucin基因具有顯著多態(tài)性（Javier, et a1, 1998），說(shuō)明此類基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生過(guò)多次突變與重排，這對(duì)在分子水平上解釋宿主與寄主進(jìn)化過(guò)程中相互選擇的機(jī)制具有重要參考價(jià)值。進(jìn)一步研究這類Mucin基因蛋白的結(jié)構(gòu)功能，有助于加深了解動(dòng)物寄生的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)動(dòng)物以及人類病原寄生蟲(chóng)的防治具有重要意義。</p>

86、<p><b>　　4 展望</b></p><p>　　從發(fā)現(xiàn)至今，Mucin基因家族的研究已有20多年的歷史，新的Mucin基因家族成員正在不斷被發(fā)現(xiàn)，例如MUC20就是2004年在IgA腎病患者中通過(guò)差異顯示技術(shù)篩選出來(lái)的一個(gè)上調(diào)表達(dá)的基因（李貴森等, 2005）。隨著對(duì)Mucin基因家族的研究不斷深入，相關(guān)疾病治病機(jī)理會(huì)逐漸明朗，許多新的免疫防治手段會(huì)得到研發(fā)。特別是近來(lái)

87、國(guó)外科學(xué)家對(duì)Mucin基因在寄生過(guò)程中扮演重要角色的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)為養(yǎng)殖業(yè)中病蟲(chóng)害的防治帶來(lái)新的突破。本文對(duì)Mucin基因進(jìn)行了大體介紹并對(duì)目前的研究狀況做了簡(jiǎn)要闡述，希望能對(duì)將來(lái)的研究有一些參考價(jià)值。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b></p><p>　　[1] 曹紅,東風(fēng),鄭偉.MUC1、MUC3在結(jié)石性膽囊炎和膽囊腺瘤樣息肉粘膜組織中的表達(dá)及

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105、計(jì)</b></p><p><b>　?。?0_ _屆）</b></p><p>　　梅氏新貝尼登蟲(chóng)Mucin基因異構(gòu)體的鑒定</p><p>　　目錄 </p><p>　　摘要（Abstract）</p>

106、<p><b>　　1 引言1</b></p><p>　　2 實(shí)驗(yàn)材料與方法錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1 原料、儀器和試劑錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1.1 原料與試劑錯(cuò)誤!未定義書(shū)簽。</p><p>　　2.1.2 主要儀器2</p>&l