玫氏新本尼登蟲(chóng)（Neobenedenia melleni）組織蛋白酶L基因克隆、表達(dá)及上游調(diào)控序列研究.pdf

1、組織蛋白酶(cathepsin)是一類(lèi)主要存在于溶酶體中的蛋白水解酶。寄生蟲(chóng)組織蛋白酶的功能涉及到寄生蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)攝取、生長(zhǎng)發(fā)育、組織分化、脫包囊/包囊形成、脫鞘出膜、宿主細(xì)胞組織入侵及免疫逃逸等過(guò)程，是抗寄生蟲(chóng)化學(xué)藥物及疫苗設(shè)計(jì)的重要靶分子。本研究采用RACE-PCR及反向PCR等技術(shù)方法，首次克隆了對(duì)多種海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)有嚴(yán)重危害的單殖吸蟲(chóng)—玫氏新本尼登蟲(chóng)組織蛋白酶L(cathepsin L)基因的全長(zhǎng)cDNA、基因組編碼序列及上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控

2、序列，并對(duì)其氨基酸序列、基因結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了序列分析；應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)cathepsin L在玫氏新本尼登蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)進(jìn)行了半定量分析；建立了cathepsin L的原核及真核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)和純化了重組cathepsin L蛋白，并以純化的重組cathepsin L蛋白制備了高效特異性玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L的抗血清。對(duì)cathepsin L DNA序列的分析揭示了玫氏新本尼登蟲(chóng)cathep

3、sin L的基因結(jié)構(gòu)及其上游調(diào)控序列存在的多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。主要研究結(jié)果如下： 1．玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L cDNA序列全長(zhǎng)1070 bp，其中5’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)20 bp，開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)1008 bp，3’端非翻譯區(qū)長(zhǎng)42 bp。推導(dǎo)的cathepsin L前體含有335個(gè)氨基酸，其中包括17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽、100個(gè)氨基酸的前體肽及218個(gè)氨基酸的成熟肽。具有保守的酶活性位點(diǎn)氨基酸殘基(C<'25>、H<

4、'159>和N<'175>)及位于前體肽中的ERF/WNIN motif。同源性分析顯示，玫氏新本尼登蟲(chóng)的cathepsin L與其它物種的cathcpsin L具有一定的同源性。 2．玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L基因組編碼序列長(zhǎng)2221 bp，由四個(gè)外顯子及三個(gè)內(nèi)含子組成，外顯子的大小依次分別為427 bp、226 bp、161 bp和236 bp，內(nèi)含子的大小依次分別為102 bp、312 bp和757 bp。

5、 3．對(duì)玫氏新本尼登蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的cathepsin L mRNA的半定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在剛排出蟲(chóng)卵及未出殼的鉤毛蚴中沒(méi)有檢測(cè)到cathepsin L mRNA的表達(dá)，在自由游泳時(shí)期的鉤毛蚴、童蟲(chóng)及成蟲(chóng)中均檢測(cè)到其mRNA的表達(dá)，而在成蟲(chóng)期的表達(dá)量較高。結(jié)果提示cathepsin L可能在玫氏新本尼登蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。 4．以成熟肽編碼序列構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-22b(+)/cathepsin

6、L并在大腸桿菌中獲得成功表達(dá)。重組蛋白以包涵體形式表達(dá)，經(jīng)變性復(fù)性處理后，利用Ni<'2+>金屬螯合層析柱和Sephadex G-25進(jìn)行純化和脫鹽，獲得的重組蛋白的純度為96﹪，Western blot結(jié)果證實(shí)，所獲得的重組蛋白為帶有6組氨酸標(biāo)記的重組蛋白。以純化的重組蛋白為抗原，免疫新西蘭雄兔，ELISA、Western blot結(jié)果顯示，制備的玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L兔抗血清具有較高的效價(jià)和特異性。 5．以編碼

7、preprocathepsin L的cDNA序列構(gòu)建了C末端帶有6組氨酸標(biāo)記的真核表達(dá)載體pcDNA3.0/cathepsin L，使用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T中進(jìn)行了表達(dá)，利用抗6組氨酸抗體及制備的玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L兔抗血清進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。 6．采用反向PCR技術(shù)克隆了玫氏新本尼登蟲(chóng)cathepsin L基因5’上游855 bp的序列，分析發(fā)現(xiàn)了多個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)如OCT1、NIT