復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑遺傳毒性的檢測(cè)

1、<p>　　復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑遺傳毒性的檢測(cè)</p><p>　　劉寧1 劉魯川※1 李雅靜2 劉娜1 董正謀1</p><p>　?。?.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所口腔科 重慶400042</p><p>　　2.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生毒理教研室 重慶400038）</p><p>　　摘 要

2、：目的:檢測(cè)復(fù)方奧-硝唑甲磺酸培氟沙星緩釋制劑是否存在潛在的遺傳毒性。方法：采用小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)，10g/kg、5g/kg、2.5g/kg以及1.25g/kg經(jīng)口灌胃給藥，取胸骨骨髓進(jìn)行檢測(cè)；組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株用平板摻入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)將受試藥品分為5個(gè)劑量（0.001μg/皿～10μg/皿），在有、無(wú)代謝活化劑 S9 的條件下對(duì)藥物進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。結(jié)果：微核數(shù)目未見(jiàn)明顯增多；TA97

3、、TA98、TA100和TA102菌株回復(fù)突變菌落未見(jiàn)明顯增多。結(jié)論：復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑未見(jiàn)潛在遺傳毒性。</p><p>　　關(guān)鍵詞：牙周炎；奧硝唑；培氟沙星；微核實(shí)驗(yàn)；Ames試驗(yàn)；遺傳毒性</p><p>　　Genetic Toxicity of Compound Ornidazole and Pefloxacinmesylat Suppository</p&

4、gt;<p>　　LIU Ning1 LIU Lu-chuan※1 LI Ya-jing2 LIU Na1 DONG Zheng-mou1</p><p>　　(1. Department of Stomatology, Daping Hospital , Third Military Medical University,ChongQing,400042 2. Department of Hyg

5、iene Toxicology , Third Military Medical University , Chongqing 400038)</p><p>　　Abstract: Objective: To detect the Compound Ornidazole and pefloxacinmesylat Suppository for potential Genotoxicity. Methods:

6、Accordance with 10g/kg、5g/kg、2.5g/kg and 1.25g/kg doses then test the bone marrow of sternum by mouse bone marrow micronucleus test in vivo . Ames Test :Histidine-defective Salmonella typhimurium TA97, TA98, TA100, and

7、 TA102 strains with the plate incorporation experiment. Subjects experiment will be divided into five doses of drugs（0.001μg/dish～10μg/dish）then test the </p><p>　　Results: No obvious difference was found be

8、tween the suppository groups and the negative control group in the micronucleus test. Ames test results showed TA97, TA98, TA100, and TA102 strains no significant increase in reverse mutation colonies.Conclusion: Compoun

9、d Ornidazole and pefloxacinmesylat Suppository has no genotoxicity.</p><p>　　Key words: periodontitis；ornidazole；pefloxacin；micronucleus；Ames test；genotoxicity</p><p>　　牙周疾病是引起牙周組織缺損并最終導(dǎo)致牙齒缺失的常見(jiàn)

10、原因。現(xiàn)已證實(shí)牙菌斑中細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物是引發(fā)牙周病必須的始動(dòng)因子，其他的一些局部因素及宿主的防御反應(yīng)也對(duì)牙周病的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生重要影響[1]。復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑[2]是我們前期研制的治療牙周炎的新型藥物。該制劑具有釋藥時(shí)間長(zhǎng)、抗菌協(xié)同互補(bǔ)和降解徹底等優(yōu)點(diǎn)。我們已對(duì)復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑的抗菌性能、穩(wěn)定性以及臨床前體內(nèi)外釋放度等性能進(jìn)行了研究，均取得較好的藥物評(píng)估結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)主要研究該藥物制劑是否存在引起基因突

11、變的遺傳毒性[3]，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料：</b></p><p>　　1.1.1 受試藥物：復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑（奧硝唑：湖南九典制藥有限公司，批號(hào)200905A05；甲磺酸培氟沙星：宜昌天仁藥業(yè)有限責(zé)任公司，

12、批號(hào)090905）。</p><p>　　1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明小鼠60只，SD大鼠1只（第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供）</p><p>　　1.1.3 試劑:環(huán)磷酰胺（CP）40mg/kg,敵克松(Dexon) 50μg/皿, 2-氨基芴(2-AF) 10μg/皿, 疊氮鈉(NaN3）1.5μg/皿, 絲裂霉素C(MMC) 0.5μg/皿。</p>&

13、lt;p>　　1.1.4 實(shí)驗(yàn)菌株:組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門菌(S. Typhi2 m urium )：TA97、TA98、TA100和TA102菌株,由第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生毒理教研室提供。 菌株在37℃震蕩增菌14 h。</p><p>　　1.1.5 活化系統(tǒng)：S-9及S-9mix，均按Ames法要求制作、使用和保存。①S-9：用多氯聯(lián)苯1254(Aroclor 1254)500mg/kg 誘導(dǎo)

14、200g SD成年雄性大鼠,5 d 后處死,處死前1 d禁食，飲水不限。斷頭處死，在無(wú)菌條件下取肝臟；在無(wú)菌冰浴條件下制作肝勻漿，TOMYRD-20型全自動(dòng)冷凍離心機(jī)(4℃)9000 g離心15 min,上清液即為S-9。經(jīng)無(wú)菌及酶活性檢查合格后，分裝于安培瓶中置-80℃冰箱中保存、備用。②S-9mix: 在S-9基礎(chǔ)上，加輔助因子及有關(guān)鹽溶液。用時(shí)現(xiàn)配，多余棄去。其中NADP、6-磷酸葡萄糖為上海博蘊(yùn)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,其他鹽溶液

15、皆用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?lt;/p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)[4]：60只昆明小鼠隨機(jī)分為6組每組10只，將受試藥物分4個(gè)劑量（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg以及1.25g/kg）和陰性對(duì)照（同體積純化水）同時(shí)經(jīng)口灌胃染毒；陽(yáng)性對(duì)照40mg/kg環(huán)磷酰胺腹腔注射染毒。24 h后頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

16、，取胸骨，止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片，甲醇固定，Giemsa染色。采用雙盲法閱片[7]，選擇著色均勻，細(xì)胞完整的區(qū)域每只小鼠油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE),觀察其中微核數(shù)(MN)，計(jì)算微核誘發(fā)率，并同時(shí)記錄視野中的200個(gè)紅細(xì)胞(RBC)數(shù)，計(jì)算未成熟紅細(xì)胞與紅細(xì)胞比值，即P／N(PCE／NCE)</p><p>　　1.2.2 用標(biāo)準(zhǔn)Ames法,按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(

17、衛(wèi)生部GB15193 ,4294) 規(guī)定的方法所進(jìn)行, 全部采用平板摻入試驗(yàn)[5]。</p><p>　　1.2.3 非活化平板摻入試驗(yàn): 向溶化并保溫在45℃的含上層培養(yǎng)基2 mL試管中依次加入供試藥液0.1 mL、增菌液0.1 mL和磷酸鹽緩沖液0.5 ml,震蕩混勻。迅速傾入底層培養(yǎng)基上使其均勻分布，5個(gè)劑量10μg/皿、1μg/皿、0.1μg/皿、0.01μg/皿和0.001μg/皿，每組3個(gè)平行板，平行

18、設(shè)陰性對(duì)照純化水0.1 mL/皿，菌株TA97和TA98陽(yáng)性對(duì)照為Dexon 50μg/皿，菌株TA100陽(yáng)性對(duì)照為NaN3 3μg/皿，菌株TA102陽(yáng)性對(duì)照為MMC 0.5μg/皿。避光靜置30min,待頂層培養(yǎng)基凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)每皿回復(fù)突變菌落數(shù)。取每組3個(gè)平行板的菌落平均數(shù)，凡高于陰性對(duì)照組2倍以上者即為陽(yáng)性結(jié)果[8]</p><p>　　1.2.4 活化平板摻入試驗(yàn): 向上層

19、培養(yǎng)基2 mL試管中依次加入供試藥液0.1 mL、增菌液0.1 mL和0.5 mL S-9mix，其他操作同上。陽(yáng)性對(duì)照2-AF 10 μg/皿。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1</p><p>　　表1 復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑對(duì)小鼠骨髓PCE微核率的影響&

20、lt;/p><p>　　組別 n PCE數(shù)（個(gè)） P／N MN誘發(fā)率(‰) P值</p><p>　　10g/kg 10 10 000 1.18 1.9±0.88 P>0．05</p><p>　　5g/kg

21、10 10 000 1.18 1.7±0.95 P>0．05</p><p>　　2.5g/kg 10 10 000 1.17 1.9±0.88 P>0．05</p><p>　　1.25g/kg 10 10 000

22、 1.21 1.8±1.03 P>0．05</p><p>　　純化水 10 10 000 1.19 1.9±0.99 P>0．05</p><p>　　CP 10 10 000 1.24

23、 25.3±6.43 P<0．01</p><p>　　由表1可見(jiàn)小鼠骨髓微核實(shí)驗(yàn)中，復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑在實(shí)驗(yàn)組的4個(gè)劑量下對(duì)小鼠的骨髓微核誘發(fā)率(‰)與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異(P>0．05)，P／N 均>1；而陽(yáng)性對(duì)照組(環(huán)磷酰胺40 mg／kg)與陰性對(duì)照組相比，差異極其顯著(P<0．01)。</p><p>　　2

24、.2 Amws試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表2</p><p>　　表2 復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑Ames試驗(yàn)回復(fù)突變菌落數(shù)</p><p>　　組別 -S9 +S9</p><p>　　(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102

25、 TA97 TA98 TA100 TA102</p><p>　　10 71±6 14±3 69±8 187±8 89±6 14±4 63±8 198±12</p><p>　　1 79±6 15±3 99

26、±3 150±12 89±6 20±4 69±7 189±7</p><p>　　0.1 87±5 13±2 115±9 161±9 94±11 22±6 61±2 149±3</p><p

27、>　　0.01 83±7 14±4 108±7 135±8 89±6 19±2 51±7 157±11</p><p>　　0.001 88±8 12±3 99±16 156±22 104±16 15±

28、;3 55±13 176±20</p><p>　　純化水 90±14 16±3 93±13 162±17 97±15 18±2 44±8 175±10</p><p>　　試劑1179±58 1320±65 947±6

29、7 2086±170 902±45 1206±232 1758±131 1973±201</p><p>　　由表2可見(jiàn)，各劑量組與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異，試劑組遠(yuǎn)高于各計(jì)量組與陰性對(duì)照組2倍以上。</p><p><b>　　3 討論：</b></p><p>　　有效地控制感染菌是治療牙周

30、炎的一種重要的輔助手段[9]。我們針對(duì)牙周病的復(fù)雜病因以及病理特點(diǎn)研制了復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑。奧硝唑是第三代硝基咪唑類藥物，其藥理作用主要以具有細(xì)胞毒作用的原藥和中間產(chǎn)物作用于細(xì)菌的DNA，使其螺旋結(jié)構(gòu)斷裂或阻斷其轉(zhuǎn)錄復(fù)制而致其死亡達(dá)到抗菌目的，有關(guān)研究已表明具有較好的抗厭氧菌療效且毒副作用小。培氟沙星作為第三代喹諾酮類藥物，其抗菌機(jī)制主要是與細(xì)菌的DNA-DNA促旋酶復(fù)合物結(jié)合，抑制DNA促旋酶活性，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。段

31、延華[10]等的研究結(jié)果表明奧硝唑和培氟沙星無(wú)配伍禁忌,可以聯(lián)合應(yīng)用，而且這兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)厭氧菌具有協(xié)同作用，與單一藥物相比效果更佳，且特殊的緩釋設(shè)計(jì)可明顯延長(zhǎng)藥物在牙周局部作用時(shí)間,有利于炎性病變部位長(zhǎng)時(shí)間維持較高的藥物濃度,達(dá)到理想的治療目的,并避免血藥峰值的出現(xiàn),減少給藥次數(shù)。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)采用微核實(shí)驗(yàn)與Ames[11]試驗(yàn)對(duì)復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑進(jìn)行了遺傳毒性測(cè)試。微核試驗(yàn)

32、作為一種檢測(cè)染色體損傷(包括染色體完整性改變和染色體分離兩種遺傳學(xué)終點(diǎn))的哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞體內(nèi)試驗(yàn)[12]與Ames試驗(yàn)在基因水平反映出遺傳物質(zhì)的受損情況配合能準(zhǔn)確反映受試物的遺傳毒理學(xué)作用。一般正常小鼠微核率約2‰，其微核發(fā)生率是檢測(cè)細(xì)胞遺傳毒性的常用指標(biāo)。Ames試驗(yàn)用菌株為鼠傷寒沙門氏菌不同組氨酸缺陷型突變株，致突變物能使組氨酸缺陷型菌株回變成原型，在缺陷的組氨酸培養(yǎng)基能夠生長(zhǎng)。當(dāng)受試物的回復(fù)突變菌落數(shù)是同實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照組或空白對(duì)

33、照組的2倍以上時(shí)，且能顯示劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)就可認(rèn)為受試物具有致突變作用或致癌作用。在本實(shí)驗(yàn)中小鼠的骨髓微核誘發(fā)率各劑量組與陰性對(duì)照組比較均無(wú)顯著差異，環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果為P<0．01，與陰性對(duì)照組有顯著性差異且微核率明顯高于各劑量組。受試藥物不能引起小鼠骨髓微核增多，說(shuō)明本藥物對(duì)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞染色體無(wú)影響，不引起染色體損傷而導(dǎo)致遺傳毒性。由表2可見(jiàn)，復(fù)方奧硝唑-甲磺酸培氟沙星緩釋制劑細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中非活化與活化平板摻入法，各

34、菌株對(duì)應(yīng)各個(gè)劑量組菌落</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　　[1] Giuseppe Valenza, Simone Veihelmann, Jörg Peplies, et al, Ulrich Vogel Microbial changes in periodontitis successfully treated by

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