復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑對大鼠生殖毒性研究.pdf

1、背景和目的：
　　 牙周病是一種病因復(fù)雜的微生物感染性疾病，在世界范圍內(nèi)均有較高發(fā)生率。不僅影響咀嚼功能，而且還與許多疾病密切相關(guān)，嚴(yán)重危害人類心身健康?？咕幬锸茄乐懿≈委煹氖侄沃?，在牙周病治療中占有重要地位。相比于傳統(tǒng)藥物治療，牙周局部抗菌緩控釋制劑具有一些不可比擬的優(yōu)點，為牙周病治療開辟了一種全新的給藥途徑。
　　 復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑是牙周局部抗菌緩控釋制劑的應(yīng)用代表之一，其前期實驗已取得較滿意

2、效果。為了進(jìn)一步臨床研究和開發(fā)應(yīng)用，本研究對該制劑進(jìn)行動物生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗，以觀察動物的配子發(fā)育、交配、受精與著床等情況，同時探討其毒性作用機(jī)制。
　　 材料和方法：
　　 1.雌、雄SD大鼠各100只，體重(200±20) g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對照、低、中、高劑量組和干預(yù)組，各每組20只分籠喂養(yǎng)；低、中、高劑量組每日按體質(zhì)量灌服復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑(1g/kg、4 g/kg、8 g/

3、kg)，陰性對照組灌服雙蒸水，雄鼠連續(xù)給藥42 d 至交配成功，雌鼠為交配前2 w 至妊娠第7 d 連續(xù)給藥；
　　 干預(yù)組按體質(zhì)量腹腔注射CP(40mg/kg)，連續(xù)5 d；雄鼠交配成功后處死，雌鼠妊娠第15 d 處死。
　　 2.管理期間每日觀察大鼠外觀、行動、飲水和死亡等情況；處死后大體解剖，對比觀察主要臟器，如心、肺、腎、肝、脾臟等，記錄異常情況。
　　 3.雄鼠每周記錄體質(zhì)量變化，雌鼠交配前每周、交配后

4、每5 d 記錄體質(zhì)量變化。
　　 4.雌雄大鼠按1：1交配，記錄交配成功時間，觀察生育力、受孕力；睪丸、附睪、卵巢和子宮稱其質(zhì)量并計算其系數(shù)。
　　 5. 取附睪組織于生理鹽水中制成精子懸液，37 ℃孵育15 min，室溫(26）℃下10min內(nèi)完成精子活動度分級和計數(shù)：精子懸液甲醇固定，伊紅染色后，鏡下觀察畸形精子，包括香蕉形、胖頭、雙頭、無溝、尾折迭、雙尾、無定形，計算畸形率。6. 暴露兩側(cè)卵巢及子宮，用放大鏡檢查黃

5、體數(shù)；沿子宮角背側(cè)縱行切開，暴露植入體，檢查著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)，計算著床前死亡率和著床后死亡率。
　　 7. 取睪丸、附睪、卵巢和子宮組織，10％中性甲醛固定，脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　 8.大鼠處死前腹主動脈取血，離心，取上清，用酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定血清T、E2。
　　 9. 石蠟切片脫蠟至水，滅活內(nèi)源性酶，抗原熱修復(fù)，滴加封閉液，加一抗過夜，

6、加二抗，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察睪丸、卵巢組織PCNA、Bax表達(dá)，進(jìn)行半定量分析。
　　 10. 取出睪丸，以銳利薄刀片快速將其切割成1mm3大小，置于4 ℃、2.5％戊二醛固定液中浸泡固定，常規(guī)制作透射電鏡標(biāo)本，電鏡下觀察睪丸超微結(jié)構(gòu)。
　　 11. 準(zhǔn)確稱量睪丸，加一定體積生理鹽水，冰浴下研磨6 min 制成勻漿，低溫(4 ℃)下2 000r/min 離

7、心15 min，取上清，按試劑盒方法測定蛋白含量、MDA 含量和SOD活力。
　　 12. 一步法提取睪丸組織總RNA，將總RNA、ABP、Inhibin-a 引物和PCR 試劑等混勻后放入PCR 儀中反應(yīng)擴(kuò)增，獲得目的DNA 片段，取5 μLDNA 片段與1μL 加樣緩沖液混勻，加至凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)下成像，掃描目標(biāo)DNA 片段灰度，進(jìn)行ABP、Inhibin-a基因半定量分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.

8、大鼠一般情況較好，雄鼠在第2 w、3 w、4 w時干預(yù)組、高劑量組、陰性對照組各死亡1只；雌鼠在第2 w 低劑量組、干預(yù)組各死亡1只，妊娠第5 d時陰性對照組、高劑量組各死亡1只；大體解剖對比觀察主要臟器無異常。
　　 2.雄鼠從第4 w 起高劑量組體質(zhì)量減輕，雌鼠從妊娠第5 d 起高劑量組體質(zhì)量減輕，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3.各組大鼠交配成功時相差不大，成功率達(dá)95％以上，生育率、受孕率

9、均達(dá)94％以上，組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；高劑量組睪丸、附睪、卵巢系數(shù)減小，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 4.高劑量組A、B級精子減少，C、D級精子增加，精子數(shù)量減少，香蕉形、胖頭、雙頭、無鉤、尾折迭、雙尾和無定形精子均有不同程度增加，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 5.大鼠早期胚胎發(fā)育檢查黃體數(shù)、著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)、著床前死亡率和著床后死亡率組間比

10、較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。
　　 6.組織病理學(xué)觀察高劑量組睪丸生精上皮變薄，細(xì)胞排列紊亂，間隙增大；輸出小管、附睪管上皮明顯變薄，細(xì)胞減少，管間疏松；卵巢卵泡數(shù)量減少，黃體細(xì)胞排列疏松。
　　 7. 血清T、E2 結(jié)果雄鼠高劑量組T、 E2降低，中劑量組E2下降；雌鼠高劑量組T、E2降低，中劑量組T下降，與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 8. 睪丸、卵巢在高劑量組PCNA表達(dá)減弱、

11、 Bax表達(dá)增強(qiáng)，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 9. 透射電鏡見高劑量組生精上皮排列紊亂，細(xì)胞間隙增大；支持細(xì)胞線粒體腫脹，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)目減少；間質(zhì)細(xì)胞體積減小，質(zhì)膜皺縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)稀疏，異染色質(zhì)明顯，溶酶體增多。
　　 10. 高劑量組Mn-SOD、CuZn-SOD 活力降低，MDA 含量升高；中劑量組CuZn-SOD降低，與陰性對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05)。
　　 11. 睪丸

12、ABP、Inhibin-a基因表達(dá)高劑量組ABP和inhibin-a基因表達(dá)量降低，與陰性對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.復(fù)方奧硝唑甲磺酸培氟沙星牙周緩釋制劑在其臨床設(shè)計劑量范圍內(nèi)對動物的生育力和早期胚胎發(fā)育無毒性作用。
　　 2.高劑量制劑可引起雄鼠體質(zhì)量減輕，睪丸、附睪系數(shù)減小，精子活動能力降低、計數(shù)減少、畸形率增加，睪丸和附睪發(fā)生形態(tài)學(xué)改變；血清T、E2降低，睪丸PCNA表