酢漿草假尾孢毒素提取、純化以及鑒定.pdf

1、紅花酢漿草(Oxalis corymbosa DC.prodr.)原產于美洲熱帶地區(qū)，現(xiàn)在是我國一種重要的入侵生物，具有極強的耐逆性、繁殖和生長能力，主要的繁殖方式為鱗莖繁殖。在中國的南方和北方均已經蔓延，對我國的糧食作物及辣椒、花生、大豆、西瓜等造成了嚴重的損害，部分地區(qū)的損失率到達100％。紅花酢漿草對草坪的損害也很嚴重，在重慶北碚的結縷草草坪中，紅花酢漿草已成為草坪雜草的優(yōu)勢種，全年的發(fā)生頻度多數(shù)時期都在0.5以上。對紅花酢漿草的

2、防治，目前主要是化學防治?；瘜W防治雖然能在一定程度上能控制雜草的發(fā)生，但是對環(huán)境的損害、污染是不可忽視的，甚至威脅到人類的健康。紅花酢漿草葉斑病是紅花酢漿草的一種重要病害，病斑中央部分呈現(xiàn)淺褐色，邊緣呈現(xiàn)暗褐色，斑點周圍具淺黃褐的暈圈，在重慶市發(fā)生嚴重，部分地區(qū)造成紅花酢漿草的大面積死亡，具有作為生物除草劑的潛力。
　　 本試驗目的是通過對紅花酢漿草葉斑病致病菌的分離，產毒培養(yǎng)，毒素提取、純化到高效液相色譜初步鑒定，為紅花酢漿草

3、葉斑病菌作為生物防治的生物農藥生產菌提供一個可靠的依據。試驗主要結果如下：
　　 在紅花酢漿草葉斑病病發(fā)病期間，挑選典型病斑，分離病原菌。對所得到的菌株通過致病性測定確定菌株的致病力。結果顯示分離得到的菌株SX-01-01的致病力最強。利用誘導產毒發(fā)酵液改良培養(yǎng)基Fries'3對分離得到的致病力較強菌株SX-01-01進行產毒發(fā)酵。從發(fā)酵培養(yǎng)第3天開始，發(fā)酵瓶中出現(xiàn)棕黃色菌絲小球。菌絲球的表面布滿了小刺，小刺柔軟，在培養(yǎng)基中能隨

4、著培養(yǎng)基擺動而擺動，基部韌性較差，容易脫落，小刺圓錐型，基部較寬，深褐色，頂端細，呈淺褐色。第9天菌絲球到達最大。經觀察，菌絲球表面的小刺由菌絲組成，中間菌絲致密地纏繞形成小刺骨架，基部較寬而尖端纖細呈圓錐形，骨架向四周放射生長出松散的菌絲，對小刺骨架形成包圍。菌絲球內部結構的顯微照相顯示，菌絲球表面菌絲致密，向內漸漸地變得稀疏，中心區(qū)域被培養(yǎng)液所占據，沒有菌絲生長。對發(fā)酵液進行粗提，并進行離體葉片生物測定，結果顯示酢漿草假尾孢菌SX-

5、01-01菌株在液體培養(yǎng)基改良Fries'3中，經過一段時間的培養(yǎng)以后，可以產生對紅花酢漿草有致毒作用的毒素物質。對發(fā)酵過程中各個時期的菌絲球直徑進行測量，結果表明菌絲球在第8天直徑達到最大9.61mm。從毒素在葉片上產生的褪綠斑直徑的分析數(shù)據可以得出，在第9天毒素所產生的褪綠斑的直徑達到最大20.24mm。菌絲球直徑與毒素的產量的變化基本保持一致。對毒素進行粗提后，選用極性分別為0.01、3.40、4.40的石油醚、二氯甲烷、氯仿三種

6、萃取劑對毒素粗提液進行萃取，進一步提純毒素。對萃取提純的水相和油相分別進行生物測定，發(fā)現(xiàn)三種萃取劑中二氯甲烷對該毒素的萃取效果最好。毒素產生之后，溶解于極性較大的水溶液中，經過萃取后，又能過溶于極性相對較小的二氯甲烷中，大分子物質不易容于水，而無機物又不能被有機溶劑萃取，所以發(fā)酵產生的溶于發(fā)酵液中的毒素物質是小分子有機物；在三種萃取劑的萃取結果表明提取的毒素物質的極性在0.01和4,40之間，所以毒素的極性也較小。再對二氯甲烷萃取的油相

7、進行色譜柱層析，得到9個分離合并瓶。分別對9個分離合并瓶進行生物測定，發(fā)現(xiàn)合并瓶3、4、8、9都對葉片有毒害作用，但是毒害能力不同，其中合并瓶8的毒害能力能力最強，其次是3、4，毒害能力最差的9號合并瓶。1、2、5、6、7合并瓶和CK沒有出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象。由實驗結果得出，色譜柱層析對毒素起到分離作用，并且分離效果明顯。合并瓶3、4、8、9中都含有對紅花酢漿草有致毒作用的致毒物質，1、2、5、6、7合并瓶和CK中不含有對紅花酢漿草的致毒物質。

8、對合并瓶3、4、8、9進行高效液相色譜分析。分別用6個波長進行測定，發(fā)現(xiàn)波長為200nm、220nm、300nm和320nm時，液譜的出峰數(shù)目都比250nm和270nm少，而波長為250nm的峰高比270nm低。所以選用試驗波長270nm為含毒素分離瓶做液譜檢測。各個分離瓶的色譜檢測峰減去與CK出峰時間的檢測峰即得出毒素可能的出峰時間。結果顯示，分離瓶3中的毒素物質出峰時間可能是8.90min、9.60min，分離瓶4中的毒素物質出峰時

9、間可能是7.10min、8.90min、9.60min，分離瓶8中的毒素物質出峰時間是3.70min、3.90min、3.95min、9.20min，分離瓶9中的毒素物質出峰時間可能是3.40min、7.90min、9.20min。因為分離瓶3和4與分離瓶8和9的液譜檢測沒有重復，所以可以推測得出，酢漿草假尾孢發(fā)酵液中含有兩種或是兩種以上的毒素。
　　 經過以上試驗，進一步證明了酢漿草假尾孢菌具有潛在的生物除草劑活性，具有生防應