植物鎂離子螯合酶催化動力學研究.pdf

1、鎂離子螯合酶是植物葉綠素生物合成途徑分支的第一個酶，在依賴ATP的條件下催化將Mg2+插入原卟啉Ⅸ形成鎂原卟啉Ⅸ。它至少由三個亞基組成，分別是I亞基(40-45 k Da)、D亞基(70-90 k Da)及H亞基(140-150 k Da)。它不但催化葉綠素的合成，參與葉綠體與細胞核的反向信號轉(zhuǎn)導，而且介導ABA信號途徑以及參與基因表達調(diào)控。雖然在光合紅細菌中對鎂離子螯合酶的研究取得了大量進展，但在植物中的研究還知之甚少。因此研究高等植

2、物鎂離子螯合酶的催化動力學及其作用機理，對闡明葉綠素代謝途徑的調(diào)控、葉綠體與細胞核反向信號及葉綠體ABA信號途徑具有重要意義。
　　 本研究主要以水稻鎂離子螯合酶為對象，建立了植物鎂離子螯合酶的體外研究系統(tǒng)，對其的所有亞基及底物進行了系統(tǒng)的動力學分析，揭示了植物鎂離子螯合酶催化的機制。本研究主要得到了以下結(jié)果：
　　 克隆、表達并純化了水稻鎂離子螯合酶的所有亞基及輔助蛋白GUN4，率先建立了植物鎂離子螯合酶的體外研究系統(tǒng)

3、。利用此系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)GUN4在體外極大地增強了鎂離子螯合酶的活性，提高反應速率達16倍。這主要是通過幫助H亞基與原卟啉Ⅸ形成穩(wěn)定復合物來完成，并且這一過程需要鎂離子和ATP的參與。GUN4蛋白C末端的9或10個氨基酸對鎂離子螯合酶的激活作用至關(guān)重要，但缺失那些氨基酸并不影響與原卟啉Ⅸ的結(jié)合，并且這些氨基酸在高等植物中是保守的，而在藍細菌等中是不存在，說明這也許是高等植物GUN4蛋白特有的調(diào)控方式。
　　 通過BN/SDS-PAGE、

4、凝膠過濾和免疫印跡結(jié)果顯示，D亞基在植物體內(nèi)主要以六聚體形式存在，而I亞基則為單體或緊密的二聚體，GUN4與H亞基在體內(nèi)形成了分子量為180 kDa的復合物。
　　 底物ATP和Proto的動力學曲線為雙曲線，即符合米氏方程，而底物Mg2+則為S形曲線，符合希爾方程，對催化反應有正協(xié)同效應。I亞基和GUN4的動力學分析顯示兩者符合米氏方程，而H亞基和GUN4的復合物的動力學則符合希爾方程，存在正協(xié)同效應。并且希爾反應系數(shù)為3，說

5、明有多個H亞基和GUN4的復合物與D和I的復合物結(jié)合。并且GUN4與H及原卟啉Ⅸ復合物的形成，是整個催化反應的限速步驟。
　　 活性重組實驗表明，單雙子葉植物之間鎂離子螯合酶非常保守，各亞基相互交叉依然具有活性。而植物與光合細菌之間除D亞基重組之外其余則沒有活性。
　　 水稻中存在兩個I亞基，兩者結(jié)構(gòu)類似，但是I2亞基不但不能替換I1亞基的活性，并且還會破壞I1亞基與D亞基所形成復合物的穩(wěn)定性，從而抑制鎂離子螯合酶的活性