豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和偽狂犬病ELISA抗體檢測(cè)方法及PRRSV弱毒活疫苗研究.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)和偽狂犬病ELISA抗體檢測(cè)方法及PRRSV弱毒活疫苗研究姓名：邱德新申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：動(dòng)物遺傳育種與繁殖指導(dǎo)教師：陳煥春熊遠(yuǎn)著20031101中文摘要蛋白)克隆在ORF7編碼區(qū)下游；通過亞克隆構(gòu)建了含ORF7和ORF6的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX—KGNM，SDS—PAGE和Western—blot檢測(cè)證明：串連的ORF7、ORF6編碼的NM蛋白與GST實(shí)現(xiàn)了原核融合表達(dá)，表達(dá)

2、的融合蛋白GSTNM大小約60kDa且具有免疫學(xué)反應(yīng)活性，也適合用于建立PRRS血清學(xué)診斷方法。4檢測(cè)PRRSV血清抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法的建立在原核表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過方陣滴定，用提取的重組N蛋白(rN)和重組NM蛋白(rNM)分別建立了檢測(cè)PRRS血清抗體的rNELISA和rNMELISA，rNELISA和rNMELISA的抗原蛋白最佳包被濃度分別為498rtg／mL和44lag／mL，兩種方法的血清最適稀釋度均為l

3、：40，陰陽性判定的臨界值為O4，都表現(xiàn)出較好的敏感性、特異性和重復(fù)性，但檢測(cè)PRRSV抗體rNM—ELISA的建立在國(guó)內(nèi)外屬首次。將建立的rNELISA和rNMELISA分別與IDEXXELISA試劑盒進(jìn)行比較檢測(cè)327份豬血清，結(jié)果rN—ELISA和rNMELISA的特異性差異不大，rNMELISA與IDEXXELISA試劑盒的陽性符合率相對(duì)較高(923％)，選擇rNM—ELISA作為制備PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒的方法。在蛋白穩(wěn)定劑

4、作用下，所制備的PRRSV抗體檢測(cè)rNM—ELISA試劑盒在4℃和20℃保存穩(wěn)定期至少12個(gè)月，這為PRRSV抗體檢測(cè)提供了一種特異敏感、安全不散毒、保存期較長(zhǎng)且適合我國(guó)國(guó)情的血清學(xué)診斷方法。5豬繁殖與呼吸綜合征弱毒活疫苗研究采用轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)技術(shù)，在MARC一145細(xì)胞中增殖PRRSV克隆20株，經(jīng)過條件的優(yōu)化選擇，確定增殖PRRSV的最佳條件為：在MARC一145細(xì)胞生長(zhǎng)液中加入12％的NCS，用025％胰蛋白酶與002％EDTA以4：1

5、混合配制的細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，每個(gè)轉(zhuǎn)瓶接種PRRSV量為810863TCIDso，接毒后72—96h收毒，可得到TCID50≥10655／01mL的高滴度PRRSV溶液，為生產(chǎn)疫苗打下基礎(chǔ)。PRRSV弱毒活疫苗對(duì)豬安全無致病性，疫苗的最小免疫劑量為106TCID50，能刺激豬產(chǎn)生特異性抗體應(yīng)答，接種后14d可檢測(cè)出特異性中和抗體。疫苗內(nèi)的PRRSV滴度在凍于前后變化不大，凍干疫苗在4—8℃保存時(shí)有效期為6個(gè)月，20℃保存時(shí)有效期為18個(gè)