抗寒基因AtCBF的克隆及在百子蓮與狗牙根中的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本試驗以野生型擬南芥基因組DNA為模板，通過PCR反應(yīng)分別克隆了AtCBF1和AtCBF3的全長基因，然后分別將其插入克隆載體pMD18-T中，并分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株中保存。經(jīng)測序檢測后，兩個目的基因分別被插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304中位于CaMV35S啟動子和Nos 終止子間的NcoI和BglII酶切位點間，分別構(gòu)建AtCBF1和AtCBF3的植物表達(dá)載體，然后分別將兩個表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中。

2、為了建立狗牙根高效的愈傷誘導(dǎo)體系，我們采用L16(43)的均勻正交設(shè)計，對NAA、6-BA和2,4-D三種生長調(diào)節(jié)劑的濃度進行了優(yōu)化。通過極差分析和方差分析，同時結(jié)合他人的實驗數(shù)據(jù)，確定了狗牙根愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)培養(yǎng)基為：2,4-D2.0mg/L+BA0.1mg/L+NAA2mg/L。愈傷組織在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)2 周后可形成致密的淡黃色愈傷組織，轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3mg/L6-BA+4mg/LKT），進行光培養(yǎng)，

3、可分化出綠色的不定芽，誘導(dǎo)率為100％。不定芽在生根培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+0.3mg/LNAA）誘導(dǎo)不定根，誘導(dǎo)率可達(dá)100％。百子蓮的體細(xì)胞再生體系由試驗室的另一位同學(xué)建立。 為了確定轉(zhuǎn)化試驗中潮霉素的篩選濃度，我們設(shè)計了百子蓮抗生素敏感性試驗。在百子蓮的分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的潮霉素（0，5mg/L，10mg/L，15mg/L，20mg/L和25mg/L）。根據(jù)百子蓮的胚性愈傷組織和不定芽在這些培養(yǎng)基中的生長