四種微孢子蟲差異蛋白組學分析及NbSwp7原核表達.pdf

1、微孢子蟲(Microsporidia)是可以感染從無脊椎到脊椎動物幾乎所有動物的一類專性細胞內寄生的單細胞真核生物,種類繁多,不但可以水平傳播,而且可通過胚胎向子代傳播,每年給世界上所有養(yǎng)蠶國家?guī)韲乐氐慕洕鷵p失。
　　微孢子蟲具有基因組進化慢而基因進化快的特點,因此,進入后基因組時代后,學者們對微孢子蟲的研究焦點開始從基因轉向蛋白水平,而且研究發(fā)現微孢子蟲蛋白在其對宿主侵染過程中起著重要作用,尤其是孢壁蛋白和極管蛋白,蛋白質組學

2、已成為微孢子蟲的一個重要的研究領域。本研究以家蠶微孢子蟲和桑尺蠖分離的微孢子蟲、藍螢葉甲蟲分離的微孢子蟲、家蠶分離的內網蟲屬微孢子蟲為對象,采用雙向電泳及串聯質譜技術,旨在解析家蠶微孢子蟲與其它三種微孢子蟲之間的蛋白組成差異。
　　家蠶微孢子蟲和桑尺蠖分離的微孢子蟲、藍螢葉甲蟲分離的微孢子蟲蛋白差異研究結果表明,三者總蛋白分布大體相似,但在蛋白點種類和數量上存在明顯差異。與家蠶微孢子蟲相比,桑尺蠖分離的微孢子蟲主要缺少一個PTP3

3、點,而藍螢葉甲蟲分離的微孢子蟲則主要相對缺少多個PTP3肽段和一個NbSwp5點,后二者的極管蛋白或孢壁蛋白的分子大小或結構等可能與家蠶微孢子蟲的不同,桑尺蠖分離的微孢子蟲與家蠶微孢子蟲PTP3結構和組成可能略有差異,而藍螢葉甲蟲分離的微孢子蟲可能缺少PTP3和Swp5或是這兩種蛋白的同源性很低。PTP3和NbSwp5都與孢子組織器官結構組成和宿主侵染有關,這3種微孢子蟲同為Nosema屬,但對家蠶的致病力有強弱之分,初步分析認為以上這

4、2種蛋白與微孢子蟲的侵染性存在一定關系。除此之外,還有一些差異蛋白可能通過能量代謝、電子傳遞、物質轉運、蛋白修飾、DNA解旋及修復等途徑影響微孢子蟲的寄生、傳播等生命活動。
　　家蠶微孢子蟲與家蠶分離的內網蟲屬微孢子蟲蛋白組成差異研究表明,它們的總蛋白分布完全不同,后者比前者主要缺少PTP3、幾種類似于家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白、ATP酶和錳超氧化物歧化酶,它們分別參與孢子的結構組成、宿主侵染、能量代謝和維持體內超氧離子濃度平衡;前者

5、比后者主要缺少轉錄起始因子IIAγ-亞基、ATP依賴的RNA解旋酶、鋅依賴性氨肽酶、DNAJ類分子伴侶、翻譯延伸因子和ATP酶,它們分別參與孢子內的轉錄、翻譯、能量代謝、蛋白降解和維持細胞穩(wěn)定等活動。這兩種微孢子蟲為不同屬種,對家蠶的致病力強弱也不同,可能它們各自在其蛋白水平上的分子大小或結構等差別較大或同源性很低。家蠶分離的內網蟲屬微孢子蟲可能缺少家蠶微孢子蟲中典型結構的極管蛋白或孢壁蛋白,因而影響其對家蠶的侵染能力。除此之外,還有一

6、些差異蛋白可能通過深層次的基因或蛋白水平的調節(jié)等的不同途徑影響其各項生命活動。
　　家蠶微孢子蟲有很多孢壁蛋白,我們通過蛋白組學手段成功鑒定出一個家蠶微孢子蟲的孢壁蛋白NbSwp7,通過檢索分析,發(fā)現有關它的研究尚少,對其表達的研究尚未展開。本研究通過相關數據庫搜索、基因克隆及核苷酸測序檢測等手段成功獲得NbSwp7的編碼基因,其大小為876bp,然后以PET-30a和大腸桿菌感受態(tài)為載體,利用雙酶切、連接、轉化成功構建出重組表達

7、質粒,最后以1μmol/mLIPTG在30oС下誘導表達5h,SDS-PAGE和Western檢測后發(fā)現成功獲得表達產物,其大小略大于預測值,這可能是由于翻譯和翻譯后修飾過程中使得蛋白空間結構發(fā)生變化而造成的影響。
　　本論文通過對4種不同來源的微孢子蟲進行蛋白組學比較的研究,發(fā)現不同種類微孢子蟲在蛋白組學上存在一定差異,尤其是一些與侵染性相關的蛋白如孢壁蛋白和極絲蛋白在結構和組成上可能存在差異。本研究為微孢子蟲蛋白的種類、結構、