雌雄異株植物菠菜性別決定分子機(jī)制的初步研究.pdf

1、菠菜(Spinacia oleracea L.)系藜科(Chenopodiaceae)菠菜屬一年生或兩年生草本植物，也是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，其為雌雄異株植物。菠菜的遺傳組成為2n=2x=12，生長(zhǎng)周期短，易栽培，性型豐富，花原基異型不表達(dá)，是雌雄異株植物性別分化研究非常好的試驗(yàn)系統(tǒng)。從目前的研究概況開看，雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)等不同層次對(duì)菠菜性別分化進(jìn)行了研究，但是菠菜的性染色體至今并無(wú)定論。有關(guān)菠菜性別連

2、鎖的蛋白質(zhì)標(biāo)記和分子標(biāo)記的研究在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。菠菜性別分化相關(guān)蛋白質(zhì)標(biāo)記和分子標(biāo)記的研究對(duì)研究雌雄異株植物的性別決定和分化機(jī)制，研究和克隆與性別相關(guān)的基因以及雌雄異株植物的遺傳育種具有重要理論意義和實(shí)用價(jià)值。 鑒于此，本文以菠菜為材料，從細(xì)胞學(xué)、特異性蛋白質(zhì)分子、RAPD分子標(biāo)記及ISSR分子標(biāo)記等方面分別對(duì)菠菜的雌雄株之間的差異進(jìn)行了比較性研究，以期為菠菜的性別決定和分化機(jī)制提供可靠的理論依據(jù)，為克隆其性別相關(guān)基因奠定基礎(chǔ)

3、。主要研究結(jié)果如下： 1.利用去壁低滲的方法，對(duì)菠菜雌雄株的核型進(jìn)行了研究，結(jié)果表明菠菜的性別決定類型為XY型，雌株為XX，其核型公式為K(2n)=12=8sm+2m+2t；雄株為XY，其核型公式為K(2n)=12=8sm+2st+2t。其性染色體為同型染色體。 2.對(duì)菠菜花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在第一次減數(shù)分裂分裂后期有一對(duì)染色體發(fā)生了提前分離，認(rèn)為其是性染色體。 3.采用聚丙烯酰胺不連續(xù)垂直平板

4、凝膠電泳技術(shù)，對(duì)菠菜雌雄株幼嫩葉片和花序中的全蛋白進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，相對(duì)分子量大約在10.KD處，是菠菜雄株葉片的特異蛋白質(zhì)條帶；相對(duì)分子量大約在28 KD處，是菠菜雄花序的特異蛋白質(zhì)條帶，而相對(duì)分子量大約在95 KD、35 KD處，是雌花序的特異條帶。它們可能與菠菜的性別分化有關(guān)。 4.利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技術(shù)對(duì)菠菜雌雄株的性別差異進(jìn)行了

5、比較性研究。在200個(gè)隨機(jī)引物中，僅引物S1493、S1497在菠菜中擴(kuò)增得到2條雄性相關(guān)的RAPD標(biāo)記，長(zhǎng)度分別為261 bp、1978 bp，GC含量分別為60.6％、41.3％，前者屬于富含GC的序列，后者屬于富含AT的序列。根據(jù)序列分析結(jié)果，將這2個(gè)雄性片段分別轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的SCAR(sequence characterizedamplified regions)標(biāo)記。在該體系的基礎(chǔ)上，根據(jù)GenBank上菠菜性別相

6、關(guān)序列設(shè)計(jì)特異引物，組合形成特異引物對(duì)，其中僅一個(gè)特異引物對(duì)擴(kuò)增得到1條雄性特異片段，該片段長(zhǎng)1021 bp，GC含量為44.0％，屬于富含AT的序列。生物信息學(xué)分析表明，其包含兩個(gè)超過100個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)，其功能有待于進(jìn)一步研究。經(jīng)單株檢測(cè)和Southern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)1021 bp片段是非常穩(wěn)定的菠菜雄性特異的分子標(biāo)記，而261 bp、1978 bp兩個(gè)片段為假陽(yáng)性的。 5.利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增技術(shù)(int

7、er-simple sequence repeat，ISSR)對(duì)菠菜雌雄株的性別差異進(jìn)行了比較性研究。在74個(gè)隨機(jī)引物中，僅引物162在菠菜中擴(kuò)增得到一條雌性相關(guān)的ISSR標(biāo)記，長(zhǎng)度為1178 bp，AT含量57.7％，屬于富含AT的序列。根據(jù)序列分析結(jié)果將該片段轉(zhuǎn)化為重復(fù)性和特異性更好的SCAR標(biāo)記，經(jīng)單株和Southern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這個(gè)片段是非常穩(wěn)定的菠菜雌性特異的分子標(biāo)記，經(jīng)生物信息學(xué)分析表明，該序列是串聯(lián)重復(fù)序列，為非編碼序列