野菊遺傳多樣性及其藥材質(zhì)量評價研究.pdf

1、野菊(Chrysanthemum indicum L.)是菊科(Compositae)多年生草本植物,廣泛分布于我國東北、華北、華中、華南及西南各地,在印度、日本、朝鮮等地也有分布。生于山坡草地、灌叢、河邊水濕地、濱海鹽漬地、田邊及路旁。其干燥頭狀花序是我國一種傳統(tǒng)中藥,具有抗病原微生物、抗炎、降壓和抗癌等藥理作用,目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料等領(lǐng)域。
　　 本研究以分布于我國18個省(市)36個野菊居群為材料,從形態(tài)學、分

2、子生物學等方面對其形態(tài)性狀、遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進行分析,并對其藥材質(zhì)量進行評價,在此基礎(chǔ)上,探討種內(nèi)遺傳多樣性與藥材質(zhì)量之間的關(guān)系,為野菊資源保護和優(yōu)良種質(zhì)篩選鑒定提供理論依據(jù)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.對分布于我國不同地區(qū)36個野菊居群植株18個形態(tài)學性狀進行分析,結(jié)果顯示,野菊居群在形態(tài)學上存在豐富的遺傳變異。主成分分析法初步確定18個性狀綜合為6個主成分,其累積貢獻率達81.038％；其中花序直徑、管

3、狀花直徑、舌狀花長、舌狀花寬、花梗長等為野菊形態(tài)差異的主要因素。利用歐式遺傳距離進行UPGMA聚類可將36個居群分為6個類群；根據(jù)主成分分析結(jié)果和各類群特點,提出了野菊的分類標準,該標準對今后野菊種質(zhì)的評價具有一定的指導意義。
　　 2.利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標記技術(shù),對分布于我國36個野菊居群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。24條ISSR引物共擴增出238條大小在200

4、 bp-1600 bp清晰的譜帶,其中205條具有多態(tài)性,總多態(tài)位點百分率為86.13％,表明在物種水平上有較高的遺傳變異。居群水平的多態(tài)性相對較低,多態(tài)百分率在18.57％～60.52％之間,平均41.24％。用POPGENE軟件計算各居群間和居群內(nèi)的遺傳參數(shù),結(jié)果表明:物種水平上的Nei’s遺傳多樣性(He)為0.194,Shannon信息指數(shù)為0.353,Nei’s基因分化系數(shù)(Gst)為0.421,表明居群間的遺傳變異占總變異的

5、42.10％,而居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的57.90％,這與有限的基因流有關(guān)。野菊居群間的基因流較為有限(Nm=0.687),明顯低于異花傳粉植物的平均值,表明野菊的基因流不足。種子生活力低可能降低了因種子傳播而產(chǎn)生的基因流?；蛄鞑蛔愫头N子的傳播距離、種子極低的生活率以及居群間的地理隔離和營養(yǎng)繁殖等因素可能是導致野菊居群遺傳分化的主要原因。聚類分析顯示,當相似系數(shù)為0.70時,可將36個居群分為6個類群。
　　 3.應(yīng)用SRA

6、P(Sequence-Related Amplified Polymorphism)標記對分布于我國36個野菊居群進行遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)分析,從400對引物組合中篩選得到28對多態(tài)性引物組合,共擴增出253條多態(tài)性條帶,平均每個引物組合產(chǎn)生9.04條多態(tài)性條帶,顯示較高的多態(tài)性。在物種水平上,多態(tài)性位點百分率(PPL)高達87.22％,Nei's遺傳多樣性(He)為0.362。居群水平上PPL在31.51％～63.80％之間,平均

7、為46.89％。Gst為0.436,Nm為0.646.表明居群內(nèi)遺傳變異較大,聚類分析顯示,當相似系數(shù)為0.75時,可將36個居群分為7個類群。與ISSR標記結(jié)果略有差異,但基本呈現(xiàn)一致性。
　　 4.對分布于我國36個野菊居群核糖體ITS(Intergenic Spacer region)堿基序列進行比較分析。結(jié)果顯示,野菊ITS區(qū)長度為719～720 bp,ITS1、5.8S和ITS2序列長度分別為291 bp、184 bp

8、和245 bp。整個ITS區(qū)共有9個變異位點,均為信息位點。其中ITS1區(qū)有7個變異位點,ITS2區(qū)有1個變異位點,5.8S區(qū)較為保守,僅有1個變異位點。根據(jù)兩者序列以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹,表明野菊種內(nèi)至少存在6個變異類型。ITS基因型與野菊的地理分布具有一定的相關(guān)性,但也有部分不一致,其主要原因可能為野菊種內(nèi)復雜的倍性。
　　 5.采用PCR測序技術(shù)對分布于我國36個野菊居群trnL-F序列進行測定及比較分析。結(jié)果表明,擴

9、增獲得的序列長440～441 bp,A+T含量為62.6％～62.9％；當空位始終作缺失處理時,整個trnL-F區(qū)有3個變異位點。主要以堿基的插入和缺失(主要是插入/缺失)為進化形式,其余的發(fā)生了少數(shù)置換。采用鄰接法得到的36個野菊居群的分子系統(tǒng)樹,表明野菊種內(nèi)至少存在4個變異類型。與ITS標記結(jié)果略有差異,但基本呈現(xiàn)一致性。
　　 6.對不同采收期及不同部位野菊活性成分進行比較分析,以期為生產(chǎn)實踐中確定最佳采收期及合理開發(fā)利用

10、野菊資源提供一定的理論依據(jù)。結(jié)果表明,野菊花不同開放度和野菊不同部位活性成分含量存在明顯的差異.針對不同的藥用目的,選擇的最佳采收期也各不相同。且在利用野菊頭狀花序的同時,應(yīng)積極開發(fā)葉片等非傳統(tǒng)藥用部位,擴大藥源,實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。
　　 7.以總黃酮、多糖、槲皮素、木犀草素、芹菜素、刺槐素、蒙花苷、綠原酸、咖啡酸等活性成分為評價指標對不同居群野菊花藥材進行質(zhì)量評價研究。結(jié)果表明,不同居群野菊花中化學組分相似,但含量存在顯著

11、差異?？傸S酮含量在2.87％～13.50％之間,多糖含量在3.12％～5.00％之間,蒙花苷含量在0.25％～2.31％之間。通過聚類分析可將37個居群野菊花分為5類,各類群中活性成分含量存在顯著差異,可以根據(jù)不同的需求進行種質(zhì)選育,同時為野菊花藥材質(zhì)量評價和品種選育提供一定理論依據(jù)。
　　 8.以商品性狀、活性成分、檢查項目等為指標,采用綜合主成分分析法,綜合考察不同居群野菊花藥材質(zhì)量,為野菊花藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。結(jié)果表

12、明,提出的綜合主成分評價較全面的反映了藥材樣本的信息,可用于中藥多指標的質(zhì)量評價。評價結(jié)果具有一定的客觀性,與系統(tǒng)聚類法結(jié)果一致。其中安徽阜陽、安徽宣城、安徽滁州、安徽安慶、安徽合肥和貴州貴陽等地野菊花中活性成分含量較高,產(chǎn)量較高,適合于種植推廣。
　　 9.采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)測定不同居群野菊花中B,Na,Mg,P,K,Ca,Mn,Fe,Cu,Hg,Zn,Sr,Se,Ba和Pb共15種元素的含量,應(yīng)

13、用相關(guān)性和主成分分析法對測定結(jié)果進行研究。結(jié)果顯示,不同居群野菊花中礦質(zhì)元素的含量呈現(xiàn)相似的元素譜排列,表現(xiàn)為上下起伏的波浪狀分布,不同產(chǎn)地野菊花中各元素的絕對含量存在顯著差異,這可能與不同種質(zhì)遺傳因素和土壤環(huán)境中各元素的豐度相關(guān)。部分元素間存在顯著正相關(guān)性,說明野菊對其吸收可能存在協(xié)同作用。經(jīng)過主成分分析得出4個主因子,其累計方差貢獻率達81.014％,第一、二主因子的方差貢獻率近達60％,所對應(yīng)的P,K,Ca,Mg,Zn,Cu,Fe