野菊遺傳多樣性及其藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)研究.pdf

1、野菊(Chrysanthemum indicum L.)是菊科(Compositae)多年生草本植物,廣泛分布于我國(guó)東北、華北、華中、華南及西南各地,在印度、日本、朝鮮等地也有分布。生于山坡草地、灌叢、河邊水濕地、濱海鹽漬地、田邊及路旁。其干燥頭狀花序是我國(guó)一種傳統(tǒng)中藥,具有抗病原微生物、抗炎、降壓和抗癌等藥理作用,目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、飲料等領(lǐng)域。
　　 本研究以分布于我國(guó)18個(gè)省(市)36個(gè)野菊居群為材料,從形態(tài)學(xué)、分

2、子生物學(xué)等方面對(duì)其形態(tài)性狀、遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系進(jìn)行分析,并對(duì)其藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),在此基礎(chǔ)上,探討種內(nèi)遺傳多樣性與藥材質(zhì)量之間的關(guān)系,為野菊資源保護(hù)和優(yōu)良種質(zhì)篩選鑒定提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)分布于我國(guó)不同地區(qū)36個(gè)野菊居群植株18個(gè)形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,野菊居群在形態(tài)學(xué)上存在豐富的遺傳變異。主成分分析法初步確定18個(gè)性狀綜合為6個(gè)主成分,其累積貢獻(xiàn)率達(dá)81.038％；其中花序直徑、管

3、狀花直徑、舌狀花長(zhǎng)、舌狀花寬、花梗長(zhǎng)等為野菊形態(tài)差異的主要因素。利用歐式遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類可將36個(gè)居群分為6個(gè)類群；根據(jù)主成分分析結(jié)果和各類群特點(diǎn),提出了野菊的分類標(biāo)準(zhǔn),該標(biāo)準(zhǔn)對(duì)今后野菊種質(zhì)的評(píng)價(jià)具有一定的指導(dǎo)意義。
　　 2.利用ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)分布于我國(guó)36個(gè)野菊居群的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。24條ISSR引物共擴(kuò)增出238條大小在200

4、 bp-1600 bp清晰的譜帶,其中205條具有多態(tài)性,總多態(tài)位點(diǎn)百分率為86.13％,表明在物種水平上有較高的遺傳變異。居群水平的多態(tài)性相對(duì)較低,多態(tài)百分率在18.57％～60.52％之間,平均41.24％。用POPGENE軟件計(jì)算各居群間和居群內(nèi)的遺傳參數(shù),結(jié)果表明:物種水平上的Nei’s遺傳多樣性(He)為0.194,Shannon信息指數(shù)為0.353,Nei’s基因分化系數(shù)(Gst)為0.421,表明居群間的遺傳變異占總變異的

5、42.10％,而居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的57.90％,這與有限的基因流有關(guān)。野菊居群間的基因流較為有限(Nm=0.687),明顯低于異花傳粉植物的平均值,表明野菊的基因流不足。種子生活力低可能降低了因種子傳播而產(chǎn)生的基因流?；蛄鞑蛔愫头N子的傳播距離、種子極低的生活率以及居群間的地理隔離和營(yíng)養(yǎng)繁殖等因素可能是導(dǎo)致野菊居群遺傳分化的主要原因。聚類分析顯示,當(dāng)相似系數(shù)為0.70時(shí),可將36個(gè)居群分為6個(gè)類群。
　　 3.應(yīng)用SRA

6、P(Sequence-Related Amplified Polymorphism)標(biāo)記對(duì)分布于我國(guó)36個(gè)野菊居群進(jìn)行遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)分析,從400對(duì)引物組合中篩選得到28對(duì)多態(tài)性引物組合,共擴(kuò)增出253條多態(tài)性條帶,平均每個(gè)引物組合產(chǎn)生9.04條多態(tài)性條帶,顯示較高的多態(tài)性。在物種水平上,多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPL)高達(dá)87.22％,Nei's遺傳多樣性(He)為0.362。居群水平上PPL在31.51％～63.80％之間,平均

7、為46.89％。Gst為0.436,Nm為0.646.表明居群內(nèi)遺傳變異較大,聚類分析顯示,當(dāng)相似系數(shù)為0.75時(shí),可將36個(gè)居群分為7個(gè)類群。與ISSR標(biāo)記結(jié)果略有差異,但基本呈現(xiàn)一致性。
　　 4.對(duì)分布于我國(guó)36個(gè)野菊居群核糖體ITS(Intergenic Spacer region)堿基序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,野菊ITS區(qū)長(zhǎng)度為719～720 bp,ITS1、5.8S和ITS2序列長(zhǎng)度分別為291 bp、184 bp

8、和245 bp。整個(gè)ITS區(qū)共有9個(gè)變異位點(diǎn),均為信息位點(diǎn)。其中ITS1區(qū)有7個(gè)變異位點(diǎn),ITS2區(qū)有1個(gè)變異位點(diǎn),5.8S區(qū)較為保守,僅有1個(gè)變異位點(diǎn)。根據(jù)兩者序列以鄰接法建立分子系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),表明野菊種內(nèi)至少存在6個(gè)變異類型。ITS基因型與野菊的地理分布具有一定的相關(guān)性,但也有部分不一致,其主要原因可能為野菊種內(nèi)復(fù)雜的倍性。
　　 5.采用PCR測(cè)序技術(shù)對(duì)分布于我國(guó)36個(gè)野菊居群trnL-F序列進(jìn)行測(cè)定及比較分析。結(jié)果表明,擴(kuò)

9、增獲得的序列長(zhǎng)440～441 bp,A+T含量為62.6％～62.9％；當(dāng)空位始終作缺失處理時(shí),整個(gè)trnL-F區(qū)有3個(gè)變異位點(diǎn)。主要以堿基的插入和缺失(主要是插入/缺失)為進(jìn)化形式,其余的發(fā)生了少數(shù)置換。采用鄰接法得到的36個(gè)野菊居群的分子系統(tǒng)樹(shù),表明野菊種內(nèi)至少存在4個(gè)變異類型。與ITS標(biāo)記結(jié)果略有差異,但基本呈現(xiàn)一致性。
　　 6.對(duì)不同采收期及不同部位野菊活性成分進(jìn)行比較分析,以期為生產(chǎn)實(shí)踐中確定最佳采收期及合理開(kāi)發(fā)利用

10、野菊資源提供一定的理論依據(jù)。結(jié)果表明,野菊花不同開(kāi)放度和野菊不同部位活性成分含量存在明顯的差異.針對(duì)不同的藥用目的,選擇的最佳采收期也各不相同。且在利用野菊頭狀花序的同時(shí),應(yīng)積極開(kāi)發(fā)葉片等非傳統(tǒng)藥用部位,擴(kuò)大藥源,實(shí)現(xiàn)資源的可持續(xù)利用。
　　 7.以總黃酮、多糖、槲皮素、木犀草素、芹菜素、刺槐素、蒙花苷、綠原酸、咖啡酸等活性成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)不同居群野菊花藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。結(jié)果表明,不同居群野菊花中化學(xué)組分相似,但含量存在顯著

11、差異?？傸S酮含量在2.87％～13.50％之間,多糖含量在3.12％～5.00％之間,蒙花苷含量在0.25％～2.31％之間。通過(guò)聚類分析可將37個(gè)居群野菊花分為5類,各類群中活性成分含量存在顯著差異,可以根據(jù)不同的需求進(jìn)行種質(zhì)選育,同時(shí)為野菊花藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和品種選育提供一定理論依據(jù)。
　　 8.以商品性狀、活性成分、檢查項(xiàng)目等為指標(biāo),采用綜合主成分分析法,綜合考察不同居群野菊花藥材質(zhì)量,為野菊花藥材質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。結(jié)果表

12、明,提出的綜合主成分評(píng)價(jià)較全面的反映了藥材樣本的信息,可用于中藥多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)結(jié)果具有一定的客觀性,與系統(tǒng)聚類法結(jié)果一致。其中安徽阜陽(yáng)、安徽宣城、安徽滁州、安徽安慶、安徽合肥和貴州貴陽(yáng)等地野菊花中活性成分含量較高,產(chǎn)量較高,適合于種植推廣。
　　 9.采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)測(cè)定不同居群野菊花中B,Na,Mg,P,K,Ca,Mn,Fe,Cu,Hg,Zn,Sr,Se,Ba和Pb共15種元素的含量,應(yīng)

13、用相關(guān)性和主成分分析法對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行研究。結(jié)果顯示,不同居群野菊花中礦質(zhì)元素的含量呈現(xiàn)相似的元素譜排列,表現(xiàn)為上下起伏的波浪狀分布,不同產(chǎn)地野菊花中各元素的絕對(duì)含量存在顯著差異,這可能與不同種質(zhì)遺傳因素和土壤環(huán)境中各元素的豐度相關(guān)。部分元素間存在顯著正相關(guān)性,說(shuō)明野菊對(duì)其吸收可能存在協(xié)同作用。經(jīng)過(guò)主成分分析得出4個(gè)主因子,其累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)81.014％,第一、二主因子的方差貢獻(xiàn)率近達(dá)60％,所對(duì)應(yīng)的P,K,Ca,Mg,Zn,Cu,Fe