東亞飛蝗免疫組織和中樞神經(jīng)組織cDNA文庫的構(gòu)建與分析.pdf

1、害蟲防治是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分。長(zhǎng)期以來，農(nóng)業(yè)害蟲一直是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因，同時(shí)也對(duì)林業(yè)和牧業(yè)造成了巨大的災(zāi)害，其中蝗災(zāi)是三大自然災(zāi)害之一。加強(qiáng)對(duì)飛蝗的研究以及蝗災(zāi)的綜合防治，已成為關(guān)系我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素，正受到人們的極大關(guān)注。由于化學(xué)殺蟲劑的諸多害處，開發(fā)新一代環(huán)保生物農(nóng)藥勢(shì)在必行。而現(xiàn)有的生物農(nóng)藥殺蟲制劑因受到害蟲的免疫反應(yīng)作用和缺乏專一性高效靶標(biāo)而使得對(duì)害蟲的擊倒時(shí)間過長(zhǎng)。綠僵菌是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在生物

2、防治中起著重要的作用。東亞飛蝗屬直翅目昆蟲，是半變態(tài)昆蟲的代表和世界性的農(nóng)業(yè)害蟲，東亞飛蝗在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的自身的免疫體系在生物學(xué)研究方面具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。研究真菌感染后的東亞飛蝗免疫組織基因轉(zhuǎn)錄信息能獲取昆蟲分子免疫學(xué)方面的重要信息，并能為醫(yī)學(xué)，農(nóng)業(yè)，生態(tài)學(xué)相關(guān)昆蟲的比較學(xué)研究提供重要遺傳信息，同時(shí)還可以更好地理解昆蟲應(yīng)對(duì)真菌感染的防衛(wèi)機(jī)制，進(jìn)而為生產(chǎn)高效的真菌殺蟲劑和加快對(duì)有害昆蟲的生物防治提供新的策略。神經(jīng)系統(tǒng)是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育

3、、繁殖等一系列生理過程中最重要的調(diào)控系統(tǒng)之一，同時(shí)，神經(jīng)系統(tǒng)還是現(xiàn)有絕大部分化學(xué)殺蟲劑靶標(biāo)所在。因此，通過構(gòu)建高質(zhì)量的東亞飛蝗中樞神經(jīng)系統(tǒng)高質(zhì)量均一化cDNA文庫，對(duì)文庫進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序分析，會(huì)得到飛蝗神經(jīng)系統(tǒng)的大量基因轉(zhuǎn)錄信息，這樣會(huì)使得對(duì)飛蝗神經(jīng)系統(tǒng)中重要基因的發(fā)現(xiàn)及研究變得容易，從而找到對(duì)調(diào)控飛蝗的重要基因，為高效專一性生物殺蟲制劑尋找到重要的靶標(biāo)。
　　 本文以東亞飛蝗為研究材料，采用體表接種綠僵菌孢子誘導(dǎo)其產(chǎn)生免疫反應(yīng)，

4、提取接種后6-24小時(shí)的東亞飛蝗脂肪體和血細(xì)胞的mRNA，采用SMART技術(shù)和DSN均一化技術(shù)，首次成功地構(gòu)建了真菌自然侵染的昆蟲均一化cDNA文庫。對(duì)文庫進(jìn)行小量測(cè)序并對(duì)序列進(jìn)行拼接，得到259條unigene序列，這些unigene中有大量免疫相關(guān)基因的存在，但沒有任何綠僵菌基因的污染。結(jié)果表明該方法用于構(gòu)建真菌感染昆蟲的cDNA文庫是可行、有效的。
　　 本文還以東亞飛蝗包括腦和腹部神經(jīng)索在內(nèi)的中樞神經(jīng)組織為研究材料，采用

5、SMART技術(shù)和DSN均一化技術(shù)相結(jié)合的方法成功構(gòu)建了均一化cDNA文庫。對(duì)文庫進(jìn)行了大量測(cè)序，把測(cè)序EST進(jìn)行拼接得到了5089條unigene。分別用BLAST程序把這些unigene與現(xiàn)有Nt、Nr、SWISSPROT、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對(duì)，并用GO(Gene Ontology)對(duì)unigene進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的功能注釋。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.采用兩步法提取得到了高質(zhì)量的mRNA，即先用Invi

6、trogen公司的TRIZOL試劑提取總RNA，再把總RNA過柱以分離mRNA。得到了大量的mRNA，且mRNA條帶完整，為高質(zhì)量文庫的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.采用自然侵染的方式對(duì)東亞飛蝗接種綠僵菌，并成功地誘導(dǎo)了東亞飛蝗的免疫反應(yīng)。
　　 3.本研究首次構(gòu)建了以真菌自然接種方式侵染的昆蟲血細(xì)胞和脂肪體為材料的均一化cDNA文庫。小量隨機(jī)挑取克隆測(cè)序并分別通過BlastX，BlastN與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，

7、沒有發(fā)現(xiàn)任何序列與真菌基因有著明顯的相似性。分別用BLAST程序把測(cè)序所得序列與現(xiàn)有Nt、Nr、SWISSPROT、KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了比對(duì)，得到了許多昆蟲天然免疫及病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)特異基因。
　　 4.本研究首次構(gòu)建了東亞飛蝗中樞神經(jīng)系統(tǒng)均一化cDNA文庫，并對(duì)文庫進(jìn)行了大規(guī)模的測(cè)序，經(jīng)生物信息學(xué)拼接得到5089條高質(zhì)量unigene序列。通過生物信息學(xué)比對(duì)和注釋得到了994條與現(xiàn)有序列相似的unigene，這些基因中包括