不對(duì)稱RT-PCR結(jié)合芯片技術(shù)鑒別四種禽病的初步研究.pdf

1、本研究建立了一種基因芯片結(jié)合不對(duì)稱RT-PCR鑒別診斷禽流感（Avian influenza，AI）及其主要亞型（H5, H7, H9 和N1，N2）、雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）、新城疫（Newcastle disease，ND）、雞傳染性法氏囊（Infectious bursal disease，IBD)的基因芯片檢測(cè)方法。以禽流感病毒的的M基因，HA基因和NA基因，雞傳染性支氣管炎病毒的NP

2、基因, 新城疫病毒的NP基因, 雞傳染性法氏囊病毒的A節(jié)段基因構(gòu)建重組質(zhì)粒。以重組陽性質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增四種疾病的目的基因，PCR產(chǎn)物純化后作為探針點(diǎn)到氨基修飾的載玻片上。樣品RNA提取后, 以Cy3標(biāo)記的反向引物和非熒光引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將熒光素引入PCR產(chǎn)物中。擴(kuò)增處理后與芯片雜交、掃描，結(jié)果表明雜交模式與預(yù)期相符，無交叉反應(yīng)。本研究旨在證明基因芯片結(jié)合不對(duì)稱RT-PCR可有效地同步鑒別診斷禽流感及其主要亞型、雞傳染性支氣

3、管炎病、新城疫病、雞傳染性法氏囊病四種禽病，研究?jī)?nèi)容主要包括。
　　 1．探針的制備：根據(jù)GenBank 上公布的禽流感病毒序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)禽流感病毒的M 基因，H5、H7、H9 亞型HA 基因，N1、N2 亞型NA 基因的引物，并設(shè)計(jì)了雞傳染性支氣管炎病毒NP 基因、新城疫病NP 基因、雞傳染性法氏囊A 節(jié)段基因以及看家基因GAPDH 的特異性引物，并構(gòu)建重組質(zhì)粒。以重組質(zhì)粒為模板，用PCR 方法擴(kuò)增純化后，制備點(diǎn)樣探針。

4、r>　　 2．診斷芯片的制備和反應(yīng)條件的優(yōu)化：參照有關(guān)文獻(xiàn)，將已制備的探針按照設(shè)計(jì)好的陣列，點(diǎn)制到氨基修飾的載玻片上，制成芯片。在樣品的處理中，用常規(guī)方法從待檢樣品中提取RNA，以Cy3標(biāo)記的反向引物和非熒光引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，將熒光素引入PCR產(chǎn)物中，并對(duì)擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化。
　　 3．診斷芯片的效能評(píng)價(jià)：在相同條件下，提取H5-AIV、H7-AIV、H9-AIV、NDV、IBV、IBDV、H5+H7+H9 AIV混合物

5、、IBV+IBDV+NDV混合物的RNA，按優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，處理后與芯片雜交、掃描來檢測(cè)芯片的特異性。將質(zhì)粒溶液稀釋至不同滴度，分別應(yīng)用芯片方法和PCR方法檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。實(shí)驗(yàn)還評(píng)價(jià)了該診斷芯片的重復(fù)性和保存期。
　　 特異性實(shí)驗(yàn)顯示該診斷芯片可以特異性地與目的樣品雜交，無交叉反應(yīng)；敏感性實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)RT-PCR的結(jié)果已不能給出準(zhǔn)確的判斷，此診斷基因芯片的雜交信號(hào)仍然很強(qiáng)；經(jīng)過實(shí)驗(yàn)評(píng)估證明此診斷芯片重復(fù)性良好

6、，并且在室溫密閉條件下可至少保存60天以上而不影響檢測(cè)效果。
　　 ４．診斷芯片的樣品檢測(cè)及比較試驗(yàn)：分別用芯片、RT-PCR、雞胚接種檢測(cè)人工感染樣品棉拭子及組織樣品30份，記錄檢測(cè)結(jié)果，并計(jì)算符合率為100％和96.7％。現(xiàn)地收集的病死雞樣品57份，用雞胚增殖后進(jìn)行RT-PCR，同時(shí)對(duì)樣品直接進(jìn)行芯片檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法，結(jié)果表明，基因芯片與雞胚增殖后進(jìn)行RT-PCR的符合率為96.4％。通過研究結(jié)果表明，此基因芯片檢測(cè)方