牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)HSP20基因的克隆表達(dá)及其重組蛋白的免疫反應(yīng)性研究.pdf

1、牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)(Babesia bigemina)是一種對(duì)牛危害極大的血液寄生蟲(chóng)，臨床上多以發(fā)熱、貧血、黃疽、血紅蛋白尿和死亡為主要特征。本病以微小牛蜱等為主要傳播者，一旦傳入，極難徹底消滅，還可經(jīng)胎盤(pán)垂直傳播。因此發(fā)病牧場(chǎng)在短期內(nèi)不易變?yōu)榘踩翀?chǎng)，嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。目前顯微鏡觀察法仍是我國(guó)基層獸醫(yī)診斷該病的主要方法。血液涂片中發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體是確診的必要條件之一。而牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)的蟲(chóng)體形態(tài)隨病程的發(fā)展而有所變化，這給診斷帶來(lái)了一些困難。

2、因此有必要建立一套方便、準(zhǔn)確、廉價(jià)的血清學(xué)診斷體系來(lái)及時(shí)發(fā)現(xiàn)和確診該病。本研究主要包括以下三部分： 1.牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)熱休克蛋白HSP20基因的克隆 牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)HSP20基因全長(zhǎng)699bp，含有一個(gè)內(nèi)含子，編碼一個(gè)分子量為20KDα的蛋白質(zhì)。從患病牛全血總基因組中，PCR克隆該基因，構(gòu)建亞克隆載體，然后測(cè)序檢驗(yàn)。克隆的HSP20基因存在四處突變，其中第120bp處的突變(A變?yōu)镚)和第191bp處的突變(T變?yōu)镃)位

3、于內(nèi)含子區(qū)，沒(méi)有引起氨基酸序列的改變。第582bp處的突變(G變?yōu)镃)為同義突變，只有第643bp處的突變(A變?yōu)镚)使其編碼的氨基酸由蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸。 2.牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)HSP20基因的原核表達(dá)及其免疫反應(yīng)性研究 從患病牛的全血樣品中抽提總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到HSP20基因的外顯子，將其插入到質(zhì)粒pGEX-4T-2中，成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-HSP20(exon)，并在E.coli BL21(

4、DE3)中得到高效表達(dá)。 3.牛雙芽巴貝斯蟲(chóng)HSP20基因的真核瞬時(shí)表達(dá)及其免疫反應(yīng)性研究 將克隆得到的HSP20基因插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-HSP20。測(cè)序鑒定后，尾靜脈注射小鼠進(jìn)行HSP20基因的瞬時(shí)表達(dá)，取其肝臟提取總RNA，經(jīng)RT-PCR方法擴(kuò)增出一條534bp的目的條帶，表明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。用該質(zhì)粒免疫小鼠，能激發(fā)小鼠產(chǎn)生敏感的中和抗體。