絨山羊和綿羊Izumol和CD9基因的克隆及其相互作用的初步研究.pdf

1、哺乳動物受精是由一系列復(fù)雜有序的步驟組成的細(xì)胞相互作用過程，最終導(dǎo)致精卵質(zhì)膜融合形成受精卵。盡管運(yùn)用基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在精子和卵子上面各鑒定出若干與精卵融合有關(guān)的分子，但頂體反應(yīng)后的精子與卵細(xì)胞膜上的受體結(jié)合從而引發(fā)精卵融合的分子機(jī)制尚不清楚。在這些精卵融合候選分子中，只有精子上的免疫球蛋白超家族(IgSF)新成員Izumol和卵子上的四次跨膜蛋白超家族(TM4SF)成員CD9被基因敲除小鼠證明是精卵融合必需的分子。綿羊和絨山羊是

2、重要的家畜，是羊肉、羊毛和羊絨的主要來源，然而未見關(guān)于其Izumol和CD9的研究報道。本研究克隆了綿羊和絨山羊的Izumol基因組DNA和cDNA以及CD9的cDNA，并且實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中表達(dá)，然后制備并純化了小鼠抗羊Izumol的腹水多克隆抗體，用純化的Izumol抗體研究了Izumol蛋白在睪丸和精子上的細(xì)胞定位。制備了地高辛標(biāo)記的絨山羊Izumol RNA探針，用RNA原位雜交技術(shù)檢測了Izumol在睪丸中的轉(zhuǎn)錄細(xì)胞定位。用雙

3、分子熒光互補(bǔ)(BiFC)技術(shù)研究了絨山羊Izumol和CD9在人肝癌細(xì)胞內(nèi)能否直接相互結(jié)合。
　　 本研究克隆的綿羊Izumol基因長4600 bp，絨山羊Izumol基因長4598 bp，二者同源性高達(dá)99.9%，并與牛、鼠和人Izumol基因高度同源。將綿羊和絨山羊的Izumol DNA和cDNA序列對比分析后發(fā)現(xiàn)羊Izumol有多種選擇性剪接形式，其中完整的開放閱讀框(ORF)長963 bp，由8個外顯子剪接而成，編碼32

4、0個氨基酸的肽鏈。該肽鏈在C端有1個跨膜結(jié)構(gòu)域，胞外有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。絨山羊Izumol cDNA具有del69、del182和del217三種選擇性剪接異構(gòu)體；綿羊Izumol cDNA具有del69和ins30兩種選擇性剪接異構(gòu)體。所有這4種選擇性剪接均是典型的GT-AG內(nèi)含子剪接，但由于肽鏈中間缺失或者C端截短，它們都部分或全部失去了免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。對羊Izumol的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析顯示其在結(jié)構(gòu)上與小鼠Izum

5、ol相似，N端有一個氨基酸1-22組成的信號肽、C末端有一個氨基酸302-319組成的跨膜區(qū)，中間有一個氨基酸161-252組成的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，并在其上有一個潛在的N-糖基化位點(diǎn)(N205)。對15種哺乳動物的Izumol氨基酸序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)它們的序列同源性并不太高，尤其是在C末端。但也有一些極為保守的基序，如能形成二硫鍵橋的LDC和YRC基序、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域上游的CPNKCG基序、N-糖基化位點(diǎn)上游的GLTDYSFYR

6、VW基序以及絕大部分半胱氨酸殘基。這些保守特征可能與Izumol的功能有關(guān)。用Izumol cDNA序列進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究的結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致，確認(rèn)綿羊和絨山羊聚為一支并與牛親緣關(guān)系最近。綿羊和絨山羊CD9 cDNA克隆均得到1123 bp序列，包含一個681 bp的完整開放閱讀框，編碼226個氨基酸的肽鏈。該肽鏈具有典型的4次跨膜蛋白家族特征。一個N-糖基化位點(diǎn)(N50)、4個跨膜區(qū)、兩個胞外環(huán)和一個被公認(rèn)為4次跨膜蛋白家族標(biāo)志

7、的CCG基序。綿羊和絨山羊CD9氨基酸序列有99.1%相同，并與牛、鼠和人的CD9高度同源。本研究對26種動物的CD9氨基酸序列進(jìn)行了比對分析，發(fā)現(xiàn)相同科屬的動物CD9同源性很高，并且在小胞外環(huán)(SEL)上發(fā)現(xiàn)了一個前人沒注意到的極為保守的LWLR基序。另外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)前人在小鼠CD9大胞外環(huán)(LEL)上鑒定為精卵融合關(guān)鍵的SFQ(173-175aa)基序只存在于小鼠和大鼠CD9中，別的動物的CD9上并沒有這個基序；一直被稱之為“糖蛋白

8、”的CD9的N-糖基化位點(diǎn)在位置和序列上并不保守，有些動物的CD9甚至沒有糖基化位點(diǎn)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究CD9在精卵融合中的功能提供了新的線索。用CD9 cDNA序列進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究的結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類一致，確認(rèn)綿羊和絨山羊聚為一支并與牛親緣關(guān)系最近。
　　 本實(shí)驗(yàn)在大腸桿菌中表達(dá)了綿羊CD9和絨山羊Izumol重組蛋白，并成功地制作了小鼠抗羊Izumol腹水多克隆抗體。用自制的抗體進(jìn)行免疫組化研究顯示絨山羊的Izumol