抗真菌活性水稻內生菌的篩選及美達霉素生物合成中糖基化機制研究.pdf

1、微生物資源(無論是菌體本身還是其活性代謝產物)在農、林、醫(yī)、藥等各行業(yè)都有重要的利用價值，篩選更有應用價值的微生物資源或研究其天然代謝產物的生物合成途徑是當今微生物資源開發(fā)利用的兩大重要研究領域。在農業(yè)生防方面，選擇更多、更好、性能穩(wěn)定的、對寄主安全的、能作為外源基因載體的內生菌一直是生防工作者奮斗的目標；而作為有應用價值的抗生素類化合物，研究其合成代謝機制則是進行抗生素結構和活性優(yōu)化的基礎，展開這兩方面的研究具有重要的現(xiàn)實意義。

2、>　　 該文從兩個方面展開了研究工作：(一)以開發(fā)生防內生菌為目的，分離到一株對多種農業(yè)病原真菌有抑制作用的水稻內生細菌CHM-1(Bacillus licheniformis CHM-1)，對其分類地位、抑菌活性、內生定殖、防病效果與寄主的關系進行了研究；(二)對鏈霉菌AM-7161(Streptomycessp.AM-7161)產生的芳香聚酮類抗生素美達霉素(Medermycin)生物合成途徑的糖基化現(xiàn)象從分子水平上進行研究。具體

3、工作內容如下：
　　 (一)具有抑制植物病原真菌活性的水稻內生細菌分離及相關性質研究：
　　 (1)在多年水稻和油菜輪作的田塊取樣，分離多株內生細菌，篩選出對幾種重要的植物病原真菌抑制活性最強的CHM-1菌株；
　　 (2)通過離體、活體的植物病原真菌抑制作用的測定，初步探討了該菌株對幾種植物病原真菌的抑制作用及作用機理，并進行了對玉米小斑病(Bipolaris.maydis)、水稻紋枯病(Rhizoctonia

4、solani)活體防效測定，發(fā)現(xiàn)CHM-1菌株對玉米小斑病和水稻紋枯病的防治效果分別為70.22％、62.79％；
　　 (3)從形態(tài)學特征、生理生化反應、代謝類型、分子生物學等各個水平對CHM-1進行了分類鑒定，初步鑒定為一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus licheniformis CHM-1)；
　　 (4)為了將其作為候選的生防菌株開發(fā)利用，本文利用雙抗標記法研究CHM-1在水稻和油菜內的定殖作用，發(fā)現(xiàn)其在水稻

5、和油菜內的定殖不僅不會給兩種作物帶來危害，反而對其具有明顯的促生作用。
　　 (二)聚酮抗生素美達霉素生物合成途徑中糖基化修飾的研究：
　　 (1)通過同源性分析確定：鏈霉菌AM-7161的美達霉素生物合成基因簇中存在6個與脫氧六碳糖合成相關的糖基合成酶基因(med-ORF14、15、16、17、19、20)以及一個與C-糖基轉移酶基因同源的基因med-ORF8。推測這7個基因完成美達霉素結構中安哥拉糖胺的合成以及C-糖

6、苷鍵的形成；
　　 (2)通過構建這7個基因的共表達系統(tǒng)，在宿主天藍色鏈霉菌B135(Streptomyces coelicolorB135)提供糖基受體的情況下，進行共表達系統(tǒng)的異源表達，或在一個通用天藍色鏈霉菌細胞((Streptomyces coelicolor CH999)中進行異源表達，同時與產生糖基供體的菌株B135進行共培養(yǎng)(即單菌株培養(yǎng)或雙菌株共培養(yǎng))，并通過LC/MS檢測發(fā)酵產物，發(fā)現(xiàn)這7個基因的共表達可以導致

7、聚酮糖基受體(由宿主體內積累的或共培養(yǎng)體系中另一個菌株提供)轉化成帶有糖基的結構，說明這7個基因共同參與脫氧糖胺的合成和轉移過程；
　　 (3)利用PCR-Targeting介導的鏈霉菌基因突變操作系統(tǒng)(RedirectTM)將med-ORF8從美達霉素完整的生物合成基因簇中敲掉，獲得了突變基因簇，進行異源表達，獲得突變菌株；然后再克隆med-ORF8連接到鏈霉菌表達型載體上，經過原生質體轉化導入突變基因簇異源表達細胞，獲得回補

8、菌株。通過LC/MS產物分析野生型菌株、突變菌株及互補菌株的發(fā)酵產物，發(fā)現(xiàn)在med-ORF8敲掉的突變株中確實沒有美達霉素的產生，而在回補菌株中，又檢測出了美達霉素的存在，這說明med-ORF8在美達霉素的C-糖基化過程中是必不可少的基因；
　　 (4)本文構建了五個有關med-ORF8基因的原核表達體系，從中篩選出了最優(yōu)化的表達體系，并進行了誘導條件的探索，確定了med-ORF8高效可溶性表達的體系和誘導條件，這為下一步弄清楚