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1、分類(lèi)號(hào):Q窆3里:里2密級(jí):公玨單位代碼:學(xué)號(hào):100862009109玉米內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及抗真菌活性物質(zhì)的研究IdentificationandAntifungalActivitySubstancesofEndophyticBacteriafromMaize學(xué)位申請(qǐng)人:候美玲指導(dǎo)教師:董金皋教授郝志敏副教授學(xué)科專(zhuān)業(yè):微生物與生化藥學(xué)學(xué)位類(lèi)別:理學(xué)碩士授予單位:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期:二。一二年五月二十九日摘要玉米大斑病是重要的玉米葉
2、部病害之一,引起該病的病原菌為玉米大斑病菌(SetDs力辦口Pr砌turcica),嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)極大地影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前防治大斑病主要是利用抗病品種,并輔以適當(dāng)?shù)乃巹┓乐?。但由于抗病品種的單一大面積應(yīng)用往往導(dǎo)致抗性迅速喪失,化學(xué)藥劑使用又常常帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響。因此,尋求新的病害防治途徑勢(shì)在必行。利用植物內(nèi)生菌對(duì)植物病害進(jìn)行生物防治具有巨大的發(fā)展?jié)摿?,本研究從健康玉米植株?nèi)分離得到22株內(nèi)生細(xì)菌,進(jìn)一步篩選得到1株對(duì)玉米大斑病菌
3、具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌YYl菌株,經(jīng)對(duì)其生物學(xué)特性、抗菌性能、抗菌物質(zhì)及抗菌機(jī)理進(jìn)行分析與研究,獲得以下主要結(jié)果:1從健康玉米葉片中分離出的1株對(duì)玉米大斑病菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株~YYl,該菌株有較廣的抗菌譜,通過(guò)分生孢子懸浮液噴霧法檢測(cè)YYl菌株的生防效果,發(fā)現(xiàn)濃度為2104個(gè)/mL的孢子懸浮液與YYl菌株發(fā)酵液等比例混合液,對(duì)玉米大斑病菌具有較好的抑制作用。通過(guò)形態(tài)觀察,生理生化反應(yīng)及16SrDNA基因序列比對(duì),鑒定YYl
4、菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。2研究了YYl菌株的最佳發(fā)酵條件,即可溶性淀粉30%、蛋白胨20%、KH2P04002%、MnCl2001%,培養(yǎng)基初始pH90,培養(yǎng)基裝液量30mL/250mL,接種量4%,28。C120rpm搖床振蕩培養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后,發(fā)酵液對(duì)玉米大斑病菌的抑菌活性在30h時(shí)幾乎升高1倍。3對(duì)YYl菌株分泌的抗菌蛋白粗提液的抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)粗蛋白處理后致使玉米大斑病菌
5、基內(nèi)菌絲由絲狀變?yōu)榇闋?;?dāng)粗蛋白濃度為O78∥此時(shí),分生孢子萌發(fā)完全受抑制,原生質(zhì)體裂解。孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中,cAMP信號(hào)途徑相關(guān)基因表達(dá)降低,且相關(guān)基因突變菌株抑制率亦降低,推測(cè)抑菌的分子機(jī)理可能與cAMP信號(hào)途徑有關(guān)。4抗菌粗蛋白對(duì)熱穩(wěn)定,對(duì)蛋白酶不敏感,重金屬Cr3可使蛋白完全失活,并且pH活性范圍較寬,在pH6~11范圍內(nèi)抑菌活性強(qiáng),在堿性條件下穩(wěn)定,在強(qiáng)酸性條件下抑菌活性幾乎消失。粗蛋白經(jīng)分離純化并進(jìn)行SDSPAGE檢
6、測(cè)得到單一蛋白條帶YYl036,分子量約為30kD,經(jīng)MALDITOFMS分析發(fā)現(xiàn)該蛋白與烯酰輔酶A水解酶(enoylCoAhydratase)的匹配度最高。5采用高速逆流色譜(HSCCC)對(duì)菌株YYl分泌的脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)進(jìn)行分析,確定HSCCC最佳條件:檢測(cè)波長(zhǎng)為214nin,溶劑體系為乙酸乙酯:正丁醇:水(4:1:5)。經(jīng)HSCCC后生測(cè)發(fā)現(xiàn)第9個(gè)組分對(duì)玉米大斑病菌有很強(qiáng)的抑菌活性,該組分的保留時(shí)間為113~115min,進(jìn)一步經(jīng)H
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