天然與人工合成三倍體枇杷基因組變異及其DNA甲基化分析.pdf

1、雜種優(yōu)勢(shì)的利用包括二倍體雜種優(yōu)勢(shì)利用、多倍體雜種優(yōu)勢(shì)利用和功能基因優(yōu)勢(shì)利用。而生物由單倍體向多倍體的轉(zhuǎn)變，是自然界物種進(jìn)化的必然結(jié)果。植物多倍體經(jīng)常出現(xiàn)一些新的表型，如抗旱、無(wú)性生殖、抗病蟲、花期、器官體積和生物的變化等，使其更適合自身或農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，因此未來(lái)的農(nóng)作物優(yōu)勢(shì)利用可能是多倍體水平的雜種優(yōu)勢(shì)利用。而三倍體在以收獲營(yíng)養(yǎng)體為目的或可以通過(guò)無(wú)性繁殖的植物上雜種優(yōu)勢(shì)尤其突出。據(jù)前人研究，三倍體枇杷在生長(zhǎng)勢(shì)、枝條粗度、葉片大小和厚度、

2、葉片組織結(jié)構(gòu)、花器官及果實(shí)特性等方面均表現(xiàn)出較為明顯的生長(zhǎng)性狀雜種優(yōu)勢(shì)。 因此，本文以天然與人工合成的三倍體枇杷共13個(gè)株系及其親本為試驗(yàn)材料，采用ISSR、AFLP、GISH和MSAP等分子細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析方法，一方面分析了天然與人工合成的三倍體枇杷在基因組重組和三倍化過(guò)程中發(fā)生的基因組變異；另一方面則對(duì)天然與人工合成的三倍體枇杷基因組DNA甲基化的水平和遺傳模式進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。期望可以從基因組結(jié)構(gòu)變異及表觀遺傳變異

3、(DNA甲基化分析)兩個(gè)方面初步探討三倍體枇杷雜種優(yōu)勢(shì)的形成機(jī)理，取得了一定的進(jìn)展，其主要結(jié)果如下： (1)以“解放鐘”四倍體和“湖南早熟”二倍體為父母本，進(jìn)行正反有性雜交人工合成三倍體枇杷材料。由于栽培管理原因，以四倍體為父本、二倍體為母本的試驗(yàn)沒(méi)有結(jié)果；以四倍體為母本、二倍體為父本進(jìn)行有性雜交，共獲得30顆F1代種子，經(jīng)染色體數(shù)目檢測(cè)，其中9顆為三倍體，其得率為30％，其余種子中存在2株二倍體、3株四倍體和16株非整倍體，其

4、得率分別為6.7％、10％和53.3％。所獲得的三倍體F1代初步表現(xiàn)出枝條增粗、葉片增大、葉色濃綠等生長(zhǎng)性狀雜種優(yōu)勢(shì)。 (2)人工合成的三倍體枇杷基因組原位雜交(GISH)分析結(jié)果表明：以親本之一基因組DNA為探針，用另一親本基因組DNA按探針濃度40倍的比例進(jìn)行封阻，可以準(zhǔn)確區(qū)分出雜種體細(xì)胞中不同來(lái)源的染色體，17條來(lái)自父本，34條來(lái)自母本，且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的染色體結(jié)構(gòu)變異如易位和倒位等。 (3)對(duì)6個(gè)天然三倍體枇杷及其

5、母本ISSR和AFLP分析結(jié)果表明：11條ISSR引物共擴(kuò)增出條帶1540條，平均每條引物擴(kuò)增出條帶140條，其中9對(duì)引物擴(kuò)增得到差異帶26條，差異性比例為1.7％。差異條帶顯示3種類型即條帶新增、缺失和亮度增強(qiáng)，分別有11條、13條和2條，出現(xiàn)的頻率分別為42.3％、50％和7.7％。各天然三倍體株系與母本的差異類型及位點(diǎn)數(shù)有所不同，每個(gè)株系產(chǎn)生新增條帶1-3條，平均1.83條：條帶缺失1-3條，平均2.17條；條帶亮度增加僅在A36

6、8和A322兩株系各發(fā)現(xiàn)1個(gè)位點(diǎn)存在。各株系與母本差異由大到小的順序是A368、A322、A35、A348、A369、A313。但總體來(lái)說(shuō)，差異條帶占總擴(kuò)增帶數(shù)的比例僅為1.7％，相對(duì)還是較低，推測(cè)三倍體基因組可能主要來(lái)源于母本，即可能在三倍體形成過(guò)程中，與2n雌配子的形成參與有關(guān)。 12對(duì)AFLP引物共擴(kuò)增出2454條帶，平均每對(duì)引物擴(kuò)增204.5條。與母本比較，三倍體顯示差異條帶208條，差異性比例為8.5％。差異條帶存在2種類型，

7、即條帶的新增及缺失，分別有112條和96條，出現(xiàn)的頻率為53.9％及46.1％。與母本差異位點(diǎn)數(shù)目由多到少的株系為A369、A348、A35、A368、A322、A313，且均出現(xiàn)了條帶新增和缺失位點(diǎn)，新增條帶為12-25條，平均18.7條；缺失條帶從13條到22條不等，平均為16條。AFLP與ISSR分析的結(jié)果相比： ①二者的相同結(jié)果是A35與母本之間基因組差異處于6個(gè)株系的中間位置，A313與母本之間的差異最小，另外顯示A3

8、68與A322與母本之間的差異接近，A348與A369也存在同樣結(jié)果； ②不同的是ISSR分析認(rèn)為A368與A322與母本之間差異較大，A348與A369較小，而AFLP則正好獲得相反的結(jié)果，產(chǎn)生這種不一致性的原因與兩種分析方法的檢測(cè)效率和擴(kuò)增的范圍不同有關(guān)。由于擴(kuò)增的總差異性比例較低，可以獲得與ISSR相同的推測(cè)，即三倍體的形成可能與2n雌配子的形成參與有關(guān)。 (4)人工合成三倍體枇杷ISSR和AFLP分析得到以下結(jié)果

9、：11對(duì)ISSR引物共擴(kuò)增出條帶1989條，平均每條引物擴(kuò)增出180.8條。與雙親相比較，9對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)生差異帶33條，差異性比例為1.7％。差異類型共分為4種即條帶新增、條帶缺失、父本遺傳與母本遺傳，這4種差異類型在三倍體枇杷擴(kuò)增結(jié)果中出現(xiàn)的位點(diǎn)數(shù)分別為1、4、9和19個(gè)，出現(xiàn)頻率分別為3.0％、12.1％、27.3％和57.6％，可見雜種后代基因組與母本更為接近，主要由于母本提供的染色體條數(shù)較多，但也出現(xiàn)了雙親均沒(méi)有的擴(kuò)增條帶證明存

10、在少量的基因組變異。在7個(gè)三倍體株系中，與親本差異較大的為雜種6號(hào)和雜種3號(hào)，分別存在7個(gè)和6個(gè)差異位點(diǎn)，二者均出現(xiàn)了不同于雙親的擴(kuò)增條帶，其余5個(gè)株系差異位點(diǎn)數(shù)目相同，均為4個(gè)，且均沒(méi)有出現(xiàn)條帶的新增和缺失情況。 12對(duì)引物共擴(kuò)增出條帶3122條，平均每對(duì)引物產(chǎn)生條帶260.2條，其中差異條帶294條，差異性比例9.4％。差異條帶共存在4種類型，即新增、缺失、父本遺傳和母本遺傳，分別存在82、58、49和105個(gè)差異位點(diǎn)，出現(xiàn)

11、的頻率分別為27.9％、19.7％、16.7％和35.7％。由此可見，人工合成的三倍體枇杷在形成過(guò)程中發(fā)生了基因組分子水平的變異，擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)了一定比例的條帶新增和條帶缺失情況。雜種與親本之間差異位點(diǎn)由多到少的順序?yàn)殡s種8號(hào)、雜種4號(hào)、雜種1號(hào)、雜種6號(hào)、雜種19號(hào)、雜種3號(hào)、雜種2號(hào)。與ISSR結(jié)果進(jìn)行比較，AFLP在檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性方面擴(kuò)增效率更高。 (5)對(duì)6個(gè)天然三倍體枇杷株系及其母本進(jìn)行DNA甲基化分析，12對(duì)引物擴(kuò)

12、增總帶數(shù)為3879條，其中全甲基化帶數(shù)363條，半甲基化帶數(shù)241條，甲基化帶數(shù)共604條，三倍體枇杷各株系總甲基化率(全甲基化和半甲基化)為12.9％-18.3％，平均為15.8％，全甲基化率為7.6％．11.7％，平均9.7％，半甲基化率為4.7％-6.1％，平均為5.6％；二倍體母本株系的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為14.1％、7.7％和6.5％。三倍體株系基因組DNA總甲基化率由高到低依次為A348(18.3％)、A

13、35(17.8％)、A313(16.O％)、A369t(15.7％)、A322(14.3％)、A368(12.9％)，除A368較母本有所降低之外，其它5個(gè)天然三倍體株系較其母本均有提高；全甲基化率由高到低分別為．A348(12.5％)、A35(11.7％)、A313(10.1％)、A369(9.9％)、A322(9.6％)、A368(7.6％)，與總甲基化率一樣，A368較對(duì)照降低，其它株系較對(duì)照均有提高；半甲基化率較對(duì)照而言，所有三

14、倍體株系均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，最高是A35，為6.1％，其次是A313、A348和A369，均為5.8％，A368為5.3％，最小是A322，為4.7％。 (6)對(duì)7個(gè)人工合成的三倍體枇杷及其四倍體與二倍體親本進(jìn)行基因組甲基化分析，結(jié)果顯示12對(duì)引物共擴(kuò)增出條帶5302條，其中總甲基化帶數(shù)838條，全甲基化帶數(shù)和半甲基化帶數(shù)分別為605和233條，多態(tài)性比例為15.8％。母本的總甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分別為17.6％、11.

15、5％和6.2％；父本分別為16.9％、11.1％和5.9％。7個(gè)三倍體雜種F1代基因組DNA總甲基化率為13.2％-17.8％，平均為15.4％，全甲基化率為10.5％-12.2％，平均為11.7％，半甲基化率為2.2％-5.5％，平均為3.9％。與雙親進(jìn)行比較，得到如下結(jié)果： (1)三倍體枇杷總甲基化率沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)，可能升高、降低或介于雙親之間，其中升高的雜種后代為雜種19號(hào)(17.8％)；介于雙親之間的是雜種3號(hào)(17

16、.6％)；其余均有所降低，為13.2％-16.8％，包括雜種1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)和8號(hào)。 (2)全甲基化率與總甲基化呈現(xiàn)類似的規(guī)律，或升高、降低，或介于雙親之間，但大部分全甲基化率提高，包括雜種1號(hào)(11.7％)、3號(hào)(13.5％)和19號(hào)(12.3％)；其次為降低和介于雙親之間兩種情況，分別有2個(gè)株系，較雙親降低的是雜種4號(hào)(10.9％)和6號(hào)(10.5％)，介于雙親之間的是雜種2號(hào)(11.5％)與雜種8號(hào)(11.4％)。

17、 (3)半甲基化率則呈現(xiàn)出與天然三倍體枇杷一致的結(jié)果，即較親本而言均有降低的趨勢(shì)，人工合成的三倍體雜種半甲基化率為2.2％-5.5％，均低于雙親的6.2％和5.9％。 7個(gè)人工合成三倍體枇杷與其親本共呈現(xiàn)出51種甲基化變異類型，包含單態(tài)性(A1和A2)、去甲基化(B)、過(guò)或超甲基化(C)、次甲基化(D)和中間類型(E)，其出現(xiàn)的頻率分別為24.2％、28.8％、38.5％、6.6％和1.9％?？傮w來(lái)看，以過(guò)或超甲基化遺傳變異為主，