抗真菌病害基因轉(zhuǎn)化蘋(píng)果（Malus domestica）的研究.pdf

1、蘋(píng)果真菌病尤其是斑點(diǎn)落葉病(AlternariaLeafSpot)、褐斑病(Marssoninacoronaria(Ell.etDaris)Daris)輪紋病(Physalosporapiricola)、腐爛病(Valsamali)等是為害蘋(píng)果的主要真菌病害，成為影響蘋(píng)果生產(chǎn)的主要限制因子之一。利用多個(gè)防衛(wèi)基因的協(xié)同作用是一個(gè)有效的選育抗病新品種的研究策略。 通過(guò)研究影響再生的因素，優(yōu)化了嘎拉葉片、富士莖段再生體系；通過(guò)對(duì)影響農(nóng)

2、桿菌介導(dǎo)蘋(píng)果遺傳轉(zhuǎn)化因素的研究，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的嘎拉葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系。主要利用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化受體材料，將β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩O(píng)果中，獲得了嘎拉蘋(píng)果轉(zhuǎn)化植株。主要研究結(jié)果如下： 1.獲得了穩(wěn)定的蘋(píng)果離體葉片再生體系 通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)劑濃度及配比、暗培養(yǎng)時(shí)間、不同部位葉片、葉片極性等因素，確立了嘎拉和長(zhǎng)富2號(hào)葉片再生體系，發(fā)現(xiàn)在分別含BA5.0mg·L-1+NAA0.4mg·L-1和TDZ4.0mg

3、·L-1+NAA0.6mg·L-1的MS培養(yǎng)基上，以嘎拉葉片遠(yuǎn)軸面和長(zhǎng)富2號(hào)近軸面接觸培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)20d左右的暗培養(yǎng)可獲得不定芽和再生植株，嘎拉和長(zhǎng)富2號(hào)葉片再生率分別達(dá)到100％和60％。 2.獲得了長(zhǎng)富2號(hào)黃化莖段離體再生植株 通過(guò)研究基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的配比及組合對(duì)黃化莖段再生的影響，獲得了長(zhǎng)富2號(hào)黃化莖段的離體再生植株，再生頻率為83％，高于葉片。建立了長(zhǎng)富2號(hào)黃化莖段的再生體系。 3.通過(guò)對(duì)抗生

4、素濃度對(duì)不定芽再生影響的研究，優(yōu)化確定了適宜的選擇壓在嘎拉、富士蘋(píng)果轉(zhuǎn)化體系建立中，以Cef300mg·L-1和Km10mg·L-1作為適宜的抑菌素濃度和選擇壓，再生芽在含Km10mg·L-1的培養(yǎng)基上篩選，經(jīng)3～4次選擇繼代后，獲得了嘎拉蘋(píng)果的抗性芽，然后再進(jìn)行擴(kuò)繁和在含Km10mg·L-1的選擇培養(yǎng)基上選擇生根培養(yǎng)。 4.建立了嘎啦蘋(píng)果的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并將β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因?qū)敫吕O(píng)果中 通過(guò)對(duì)影響農(nóng)

5、桿菌侵染的多個(gè)因素如農(nóng)桿菌懸浮培養(yǎng)基、農(nóng)桿菌菌液濃度、處理時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間及抗生素濃度的優(yōu)化篩選，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘋(píng)果雙價(jià)基因的遺傳轉(zhuǎn)化體系。在本研究試驗(yàn)條件下，外源基因的轉(zhuǎn)化效率嘎拉高于富士；同時(shí)發(fā)現(xiàn)延遲選擇培養(yǎng)可明顯提高共培養(yǎng)后的再生芽數(shù)。通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將β-1，3-葡聚糖酶及幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩O(píng)果中，獲得了抗性植株，其通過(guò)了Km抗性篩選。 5.經(jīng)PCR檢測(cè)獲得了呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株 將含有β-1，3-葡聚糖酶及幾