裸甲藻溶藻細菌的篩選及其胞外抑藻活性物質的分離鑒定.pdf

1、在適宜的條件下，一些藻類能夠急劇增加或聚集，海水中藻細胞密度銳增，使水體顏色改變，并有可能造成海洋生物死亡，這就是所謂的赤潮(redtide)現象。除了微藻外，其他一些單細胞浮游生物也能夠形成赤潮。
　　海洋水體富營養(yǎng)化是導致赤潮的直接原因。國內外對赤潮的研究已持續(xù)幾十年，前人在采用物理、化學和其他生物學方法治理赤潮不甚理想的狀況下，利用微生物進行生物控藻引起了人們的極大關注
　　目前，溶藻微生物主要包括:溶藻細菌、溶藻放線

2、菌、溶藻真菌、噬藻體、原生動物。是最具潛力的生物控制方法之一。
　　溶藻細菌(Algicidalbacteria)是指以直接或間接方式抑制或殺死藻類、溶解藻細胞的細菌統(tǒng)稱。1924年溶藻細菌首次被發(fā)現。
　　微藻中的裸甲藻，是南方海域赤潮爆發(fā)多見報道的一種優(yōu)勢藻種。
　　裸甲藻屬甲藻門，是單細胞微藻，是水生動物的餌料，大量繁殖使水體在陽光的照射下反映出紅棕色，但過量生長則形成對水產有害的“赤潮”。而且能夠產生多種毒素，

3、使魚蝦貝類死亡等，對人體亦有危害。國內外對裸甲藻引起的赤潮研究相對較少。
　　本研究依次從中國萊州灣、膠州灣以及海南三亞市紅沙港等海域采集水樣，采用液體感染法，即將劃線分離的單菌落菌液與裸甲藻培養(yǎng)物共培養(yǎng)，最終從海南三亞市紅沙港海域分離到兩株對裸甲藻(Gymnodiniumsp.)有明顯抑制效果的海洋細菌HSB01和HSB07。且細菌HSB07比HSB07抑藻效果更強。
　　通過對兩株菌的形態(tài)觀察、分子和生理生化特征鑒定，得

4、出HSB01是葡萄球菌屬，HSB07是鹽單胞菌屬。
　　通過發(fā)酵兩株菌并分離細菌菌體與胞外代謝物，然后分別與裸甲藻共培養(yǎng)試驗，發(fā)現HSB07用乙酸乙酯萃取的發(fā)酵物粗提物表現出相對明顯的抑藻作用。
　　對細菌HSB07進行20LLB海水培養(yǎng)基規(guī)模發(fā)酵，得到14g粗提物。經硅膠柱層析、薄層層析得到兩個組分B和C。
　　將適量組分B和C以DMSO（二甲基亞砜）溶解，同樣采用液體感染法，即將DMSO溶解的組分B和C分別與裸甲藻

5、培養(yǎng)物共培養(yǎng)，發(fā)現組分B具有顯著的抑藻作用，組分C亦具有一定的抑藻作用。
　　組分B和C進一步進行凝膠柱層析、液相分析與分離，從組分C分離得到一個純組分，即為組分＃12。對組分＃12采用核磁共振和質譜分析鑒定，確定其分子量為414。具體結構還需進一步分析鑒定。
　　鑒于20L規(guī)模發(fā)酵得到的生物量不夠理想，因而對細菌HSB07的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。參考20L規(guī)模發(fā)酵條件28℃、pH7.5、鹽度為3、發(fā)酵時間24～48h。以發(fā)酵

6、液的pH、鹽度和發(fā)酵時間三個因素作為影響胞外活性物質含量的主要參數。各因素選取3個水平進行正交實驗，選用L9(34)正交表設計實驗。將發(fā)酵好的細菌發(fā)酵液高速離心（6500rpm）10min，分離得到上層細菌胞外代謝物和下層菌體，收集上層液。向120ml藻培物中加入15ml細菌胞外代謝物與藻共培養(yǎng)，以溶藻率作為評價發(fā)酵條件的指標。主要實驗結果如下:
　　1.裸甲藻溶藻菌的篩選、鑒定
　　1)從海南三亞紅沙崗水樣中共分離出7株細

7、菌，其中2株細菌表現出明顯的抑藻作用，分別標記為HSB01、HSB07。抑藻試驗再驗證并進行差異顯著性檢驗得知:細菌HSB01和HSB07均具有較強的抑藻作用，且細菌HSB07比HSB01抑藻作用更強。
　　2)對2株溶藻細菌進行分子鑒定:16SrDNA測序，與Genbank中已知序列BLAST，結合生理生化特征分析，結果表明:細菌HSB01、HSB07分別屬于葡萄球菌屬（Staphylococcussp.）、鹽單胞菌屬（Halo

8、monassp.）;Genbank號分別為KC832320、KC832321。
　　3)對2株溶藻細菌的菌落進行形態(tài)觀察:細菌HSB01呈淺黃色，菌落小而圓，表面凸起，粉質，邊緣光滑;細菌HSB07透明，菌落較大而圓，濕潤黏粘而不易被挑起，邊緣不太光滑。電鏡觀察可知兩株菌均無鞭毛。
　　2.裸甲藻溶藻菌的抑藻特性
　　1)在裸甲藻生長的第14天，即藻對數生長期末期，分別加入兩株菌液，經差異顯著性檢驗得出:加入HSB07

9、菌液的藻培物一開始即與自然生長的藻培物藻密度存在顯著差異，Sig值小于0.05;而加入HSB01菌液的藻培物一開始與自然生長的藻培物藻密度差異不顯著，Sig值為0.27＞0.05，在接下來共培養(yǎng)期間，才表現出顯著差異。這表明兩株菌HSB01、HSB07都能明顯地抑制裸甲藻的生長。在藻對數生長期末期分別加入兩菌培養(yǎng)液，都能加速藻由對數生長末期進入衰退期，且HSB07作用更明顯。
　　2)對細菌HSB01、HSB07的抑藻特性進行研究

10、，發(fā)現這兩株菌的抑藻因子均不是細菌菌體，而是分泌的次級代謝產物，即間接抑藻。
　　3.裸甲藻溶藻菌中活性物質的分離提純
　　1)通過對HSB07大量發(fā)酵、乙酸乙酯萃取粗提物進行抑藻試驗表明:該粗提物具有較好抑藻活性。
　　2)經過硅膠柱層析和薄層層析，得到兩個組分B和C。
　　3)將組分B和C分別與裸甲藻培養(yǎng)物共培養(yǎng)進行抑藻試驗，發(fā)現組分B具有顯著的抑藻作用，組分C亦具有一定的抑藻作用
　　4)對組分B和C