番木瓜果實成熟期若干基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、番木瓜是一種呼吸躍變型果實,采后壽命較短,研究其成熟的機(jī)理及調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和實踐意義。通過cDNA-AFLP技術(shù)分離并分析在成熟過程中差異表達(dá)的基因是目前進(jìn)行成熟機(jī)理研究的一個重要手段。本研究在cDNA-AFLP分離出番木瓜果實成熟差異表達(dá)基因的基礎(chǔ)上,選取其中與植物的生長發(fā)育相關(guān)的的cDNA片段,進(jìn)行全長序列的克隆,利用RACE技術(shù)克隆了番木瓜WD-repeat蛋白基因和鋅指蛋白基因全長序列。并利用半定量RT-PCR的方法,研

2、究了這些基因在番木瓜果實成熟不同階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明,兩個基因在果實的四個時期均有表達(dá),且表達(dá)量隨著果實的成熟發(fā)生相應(yīng)的變化,表明其與番木瓜果實成熟的進(jìn)程有關(guān)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 1番木瓜果實WD-repeat蛋白基因的克隆與分析
　　 利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)克隆了WD-repeat蛋白基因。其全長cDNA為1091bp,含有一個780bp的開放閱讀框,編碼259個氨基酸,5’端有41bp

3、非編碼區(qū),3’端有271bp非編碼區(qū),預(yù)測相對分子量為28.66KD,等電點為7.57。根據(jù)cDNA全長推導(dǎo)氨基酸序列并與毛果楊、蒺藜苜蓿、葡萄等高等植物的WD-repeat蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對,發(fā)現(xiàn)同源性在70％以上,這說明WD-repeat蛋白基因在植物中有較高的保守性。并構(gòu)建了來自不同物種WD-repeat蛋白基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示番木瓜WD-repeat蛋白基因與葡萄表現(xiàn)出最小的進(jìn)化距離,這表明它們之間的親緣關(guān)

4、系最近。
　　 2番木瓜果實鋅指蛋白基因的克隆與分析
　　 采用cDNA末端快速擴(kuò)增方法,獲得了番木瓜果實鋅指蛋白基因的全長序列。其全長序cDNA為1378bp,含有一個1023bp的開放閱讀框,編碼340個氨基酸。5’端有41bp非編碼區(qū),3’端有271bp非編碼區(qū),預(yù)測相對分子量為36.95KD,等電點為4.79。根據(jù)cDNA全長推導(dǎo)氨基酸序列與擬南芥、葡萄、毛果楊等高等植物鋅指蛋白基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性對比分析

5、并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示同源性在51％以上,番木瓜與葡萄表現(xiàn)出最小的進(jìn)化距離,這表明它們間的親緣關(guān)系最近。
　　 3半定量RT-PCR分析
　　 以Actin基因為內(nèi)參基因,利用半定量RT-PCR技術(shù)對WD-repeat蛋白基因和鋅指蛋白基因在番木瓜綠色期、半黃期、全黃期、腐熟期四個不成熟期的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明,WD-repeat蛋白基因和鋅指蛋白基因在番木瓜的四個不同成熟期均有表達(dá),且隨著番木瓜成熟表達(dá)量逐漸增