結(jié)核桿菌蛋白芯片-ELISA診斷技術(shù)研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種人畜共患的慢性消耗性傳染病。據(jù)估計(jì)，全球約有20億的人口感染結(jié)核病，精準(zhǔn)、及時(shí)高效地對(duì)結(jié)核病病人進(jìn)行診斷是治療和控制結(jié)核病所必需的。結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)（PPD）是目前臨床診斷牛結(jié)核病常規(guī)的方法，也是國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織與我國(guó)規(guī)定的法定檢疫手段。然而由于PPD抗原也許包含有與其它分枝桿菌相同的抗原成份,檢測(cè)時(shí)診斷結(jié)果假陽(yáng)性高,而且此診斷方法不能區(qū)分自然感染和卡介苗免疫。此外還有其他許多結(jié)核桿菌的診斷方法如痰涂、菌培、

2、結(jié)核桿菌DNA擴(kuò)增法檢測(cè)法等,但這些方法不但需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的人員操作，而且具有檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作過(guò)程繁瑣、診斷結(jié)果敏感性低等缺點(diǎn),最終導(dǎo)致目前結(jié)核病臨床檢出率低，說(shuō)明以上檢測(cè)方法不利于結(jié)核病的檢測(cè)。為此，本實(shí)驗(yàn)研究了新型的結(jié)核病的快速診斷方法：
　　 采用多抗原多組分作為聯(lián)合診斷抗原的方法，建立一種靈敏度好，高特異性的血清學(xué)診斷方法。提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組DNA，采用分子克隆表達(dá)技術(shù)擴(kuò)增TB9.7、38KD、

3、MPB83和MPB70基因片段，通過(guò)pET-32a構(gòu)建質(zhì)粒載體pET-32a-TB9.7、pET-32a-38KD、pET-32a-MPB83和pET-32a-MPB70，經(jīng)測(cè)定序列正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組蛋白的含量，同時(shí)用蛋白純化試劑盒，完成ESAT-6、CFP10、ACR、Rv2626c、TB9.7、38KD、MPB83、MPB70和FadB4的蛋白純化，并且進(jìn)行western blot檢

4、測(cè)。將九種抗原分別進(jìn)行iELISA條件的優(yōu)化，制備可視化簡(jiǎn)易蛋白芯片，建立“芯片”式iELISA診斷方法，并確定了ELISA診斷方法的判斷標(biāo)準(zhǔn)，即S/P≥任一抗原陽(yáng)性臨界值為陽(yáng)性,S/P<所有抗原陰性臨界值為陰性。ELISA方法的特異性為97.5%，敏感性為73.3%。對(duì)30份痰檢陽(yáng)性和120份健康人血清樣品進(jìn)行了檢測(cè),并與痰檢結(jié)果比較。30份痰檢陽(yáng)性血清樣品中有22份為ELISA檢測(cè)陽(yáng)性,陽(yáng)性符合率為73.3%,120份健康人血清，3