小麥擴(kuò)展蛋白基因TaEXPB23的功能研究.pdf

1、小麥?zhǔn)鞘澜缧缘闹匾Z食作物，在我國是僅次于水稻的第二大糧食作物，其生長和產(chǎn)量直接關(guān)系到人類食物的供應(yīng)。干旱脅迫嚴(yán)重影響小麥的生長和產(chǎn)量。研究小麥生長發(fā)育調(diào)控及抗旱機(jī)制對于提高干旱條件下小麥產(chǎn)量具有重要意義。生長是植物最基本的生理現(xiàn)象，它主要涉及到細(xì)胞的擴(kuò)張和分裂。近年來發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展蛋白在細(xì)胞壁擴(kuò)張過程中起著重要作用，并且已經(jīng)證實(shí)擴(kuò)展蛋白在提高玉米等作物的抗旱性方面也起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期從小麥胚芽鞘中克隆了擴(kuò)展蛋白基因，命名TaEXP

2、B23（GenBank注冊號：AY260547），構(gòu)建了含35S強(qiáng)啟動(dòng)子的基因表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草獲得過量表達(dá)TaEXPB23的轉(zhuǎn)基因株系多個(gè)。本文首先從形態(tài)、細(xì)胞學(xué)、植物生理學(xué)方面，觀察研究了過量表達(dá)TaEXPB23基因?qū)煵萆L發(fā)育的影響；其次，將基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了過量表達(dá)該基因的擬南芥株系；借助于擬南芥發(fā)育基因的遺傳背景，初步研究了過量表達(dá)TaEXPB23基因?qū)ιL發(fā)育調(diào)控的分子基礎(chǔ)；為降低組成型表達(dá)對轉(zhuǎn)基因植株的負(fù)面影響，克隆

3、了擬南芥干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子RD29A，構(gòu)建了TaEXPB23表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草獲得了干旱誘導(dǎo)TaEXPB23基因表達(dá)的煙草植株，研究比較了干旱誘導(dǎo)表達(dá)與強(qiáng)啟動(dòng)子組成型表達(dá)TaEXPB23基因?qū)煵萆L發(fā)育及抗旱性的影響。主要結(jié)果如下：
　　 1.組成型過量表達(dá)TaEXPB23基因?qū)煵萆L發(fā)育的影響及其生理與分子機(jī)制
　　 1.1組成型過表達(dá)TaEXPB23轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出前期生長加速，葉片變大；但生育周期變短，開花期提前

4、，后期植株高度矮，總?cè)~片數(shù)目減少，節(jié)間變長，葉片變小，根部發(fā)達(dá)等性狀。通過解剖結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草的頂端分生組織凸起較大，葉片表皮細(xì)胞稍變小，莖部細(xì)胞略變細(xì)。
　　 1.2組成型過表達(dá)TaEXPB23基因煙草葉片積累的淀粉量要少于野生型煙草，而淀粉酶活性，轉(zhuǎn)化酶活性等均高于野生型煙草。說明過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草分解利用淀粉的速度較快。分析認(rèn)為這可能與轉(zhuǎn)基因煙草適應(yīng)快速生長的需求有關(guān)。
　　 1.3將含有35S啟動(dòng)子的TaE

5、XPB23基因載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了組成型過表達(dá)TaEXPB23基因株系多個(gè)。觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型與過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的表型基本一致，均表現(xiàn)為前期生長加快，葉片加大；但是，開花期提前，生育周期變短，最終植株高度變矮。通過半定量RT-PCR檢測擬南芥部分開花相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，不論在長日照還是短日照條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中兩個(gè)抑制開花的基因EBS和FLC在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量均低于野生型；而三個(gè)促進(jìn)開花的基因CO、FT和AP1的表

6、達(dá)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中均高于野生型。說明組成型過量表達(dá)小麥TaEXPB23基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草、擬南芥生長發(fā)育過程的調(diào)節(jié)作用，可能與影響了發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。
　　 2.組成型過量表達(dá)TaEXPB23基因提高了煙草的抗旱性
　　 通過觀察與檢測在干旱脅迫下過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的細(xì)胞學(xué)和生理學(xué)指標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草可以維持較好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，失水速率相對緩慢，葉片可以維持較高的相對含水量。并且，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的光合性能的維持

7、、PSⅡ系統(tǒng)的保護(hù)也要好于野生型煙草。由于過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草能夠維持較好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以其相對電導(dǎo)率和MDA含量均低于野生型煙草，表明組成型過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性得到提高。
　　 3.干旱誘導(dǎo)表達(dá)TaEXPB23基因?qū)D(zhuǎn)基因煙草表型與抗旱性的影響
　　 為了減小組成型過表達(dá)TaEXPB23基因?qū)D(zhuǎn)基因植株的影響，從擬南芥中克隆得到在干旱、鹽漬和低溫下誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子RD29A，并將其與TaEXPB23基因連接，構(gòu)建了表達(dá)

8、載體，轉(zhuǎn)化煙草，獲得了逆境誘導(dǎo)表達(dá)TaEXPB23基因的轉(zhuǎn)基因煙草，比較研究了轉(zhuǎn)基因煙草的表型和抗旱性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因煙草在正常供水條件下表型與野生型煙草基本一致，克服了組成型表達(dá)TaEXPB23基因?qū)ιL發(fā)育的負(fù)面影響；干旱脅迫下，TaEXPB23基因在短時(shí)間內(nèi)可以被誘導(dǎo)表達(dá)，并且可以翻譯出具有活性的蛋白。誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性也得到了提高，但是略差于過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草。
　　 4.激素處理對小麥胚芽鞘中TaEXPB2