鴨瘟病毒UL51基因部分特性及其基因工程蛋白應(yīng)用的研究.pdf

1、1鴨瘟病毒UL51基因的序列特征分析及密碼子偏愛(ài)性分析根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的鴨瘟病毒(DPV)DNA文庫(kù)，并結(jié)合NCBI中的開放閱讀框(ORF)Finder和BLAST工具進(jìn)行分析，一個(gè)完整的ORF被鑒定出來(lái)。該ORF是DPV UL51基因(GenBank No.DQ072725)，大小為759bp，編碼一種皮層蛋白，并且含有一個(gè)在α-皰疹病毒亞科中保守的區(qū)域。進(jìn)化關(guān)系分析揭示DPVUL51基因與馬立克屬皰疹病毒UL51基因的進(jìn)化關(guān)系最近。

2、之后，對(duì)該基因編碼蛋白序列進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，該蛋白含有4個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)潛在的?；稽c(diǎn)和4個(gè)潛在的線性B細(xì)胞表位，表明它可能是一種磷酸化和?；牡鞍?，并且能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫反應(yīng)；同時(shí)，該蛋白不含任何的N-糖基化位點(diǎn)、跨膜區(qū)域、信號(hào)肽和核定位信號(hào)，卻含有高爾基體定位信號(hào)，表明它可能定位于胞漿的高爾基體中。對(duì)DPV UL51基因密碼子偏愛(ài)性分析的結(jié)果揭示，該基因?qū)νx密碼子中第三位為A和T的密碼子有強(qiáng)烈的偏愛(ài)

3、性，并且原核表達(dá)系統(tǒng)可能更適合該基因的表達(dá)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究DPV UL51基因的特性和功能提供了理論支持。
　　 2 DPV UL51基因的克隆、原核表達(dá)、產(chǎn)物純化及其多克隆抗體的制備根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室提供的DPV UL51基因序列，采用primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，運(yùn)用PCR方法從DPV基因組DNA中擴(kuò)增UL51基因，并將其克隆至pMD18-T載體中，經(jīng)EcoRⅠ和XhoI雙酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定正確后，將該

4、基因正向插入原核表達(dá)載體pET28a(+)的EcoRⅠ和XhoI位點(diǎn)之間，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-UL51。將該表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，用IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出了大小約為34KD的重組UL51蛋白，并且主要以包涵體形式存在；經(jīng)過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化，確定了該重組表達(dá)質(zhì)粒的最佳誘導(dǎo)條件為0.8mmol/L IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)4h。將表達(dá)產(chǎn)物用鎳柱梯度親和層析純化后，高純度的

5、表達(dá)蛋白與等量弗氏佐劑混合作為免疫原，四次免疫家兔，獲得了抗重組UL51蛋白高免血清。將該血清經(jīng)辛酸-硫酸銨粗提和High Q陰離子交換柱層析純化后，得到了特異性強(qiáng)的兔抗重組UL51蛋白抗體IgG，為進(jìn)一步研究DPV UL51基因的特性和功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 3 DPV UL51基因在感染宿主細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特征本試驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和Western blotting法檢測(cè)DPV UL51基因在鴨胚成纖維細(xì)胞(D

6、EF)中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)情況。結(jié)果表明：該基因在DPV感染后2h時(shí)已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄，8h開始表達(dá)，48h轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量都達(dá)到最高峰，之后逐漸降低；該基因在DEF細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物分子量為34KD;并且該基因表達(dá)產(chǎn)物是病毒粒子的一種組成成分。該研究為闡明DPVUL51基因的功能提供了有用的數(shù)據(jù)。
　　 4 DPV UL51蛋白在病毒感染細(xì)胞中的定位通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)DPV UL51蛋白在病毒感染細(xì)胞內(nèi)的定位特性，結(jié)果顯示，最早可在感染后

7、8h的胞漿中檢測(cè)到特異性熒光點(diǎn)，24～36h有大量綠色熒光團(tuán)塊聚集于近核區(qū)域，之后隨著細(xì)胞病變的增強(qiáng)，胞核和胞漿中的綠色熒光均開始減弱。用膠體金免疫電鏡法檢測(cè)DPV UL51蛋白在DPV感染細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，DPV UL51蛋白主要位于胞漿空泡中的病毒粒子和一些膜結(jié)構(gòu)上；此外，在感染早期，DPV UL51蛋白大量累積于高爾基復(fù)合體膜上，其后通過(guò)某種未知機(jī)理被運(yùn)送到細(xì)胞膜附近。該研究也為闡明DPVUL51蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。

8、
　　 5 DPV UL51基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)特性根據(jù)DPV UL51基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR擴(kuò)增并克隆至pMD18-T載體上，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后，再將該目的片段亞克隆到pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒pcDNA3.1-UL51，通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)入COS-7細(xì)胞；應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、Western blotting和間接免疫熒光法檢測(cè)該基因在

9、COS-7細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和定位情況。結(jié)果表明：該基因在轉(zhuǎn)染后6h時(shí)已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄，12h開始表達(dá)，24h轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量都達(dá)到最高峰，之后逐漸降低；并且該基因在COS-7細(xì)胞中得表達(dá)產(chǎn)物的分子量為33KD。間接免疫熒光法顯示該基因的表達(dá)產(chǎn)物早期聚集于近核區(qū)域，晚期定位于胞漿和胞核中。該研究也為闡明DPV UL51基因的特性和功能提供了有用的數(shù)據(jù)。
　　 6用免疫組化方法檢測(cè)DPV UL51蛋白在人工感染鴨組織中的定位和動(dòng)態(tài)分布采用

10、DPV強(qiáng)毒CHv株人工感染30日齡鴨，于攻毒后于不同時(shí)間采集法氏囊、胸腺、脾、哈德氏腺、肝、胰、食管、腺胃、小腸（包括十二指腸、空腸和回腸）、大腸（包括盲腸和直腸）、腦、腎、肺、心、肌肉組織或器官，用建立的基于重組UL51蛋白抗體的間接免疫熒光和免疫酶組化法，分別檢測(cè)DPV UL51蛋白在鴨體組織中的定位和動(dòng)態(tài)分布。結(jié)果表明，DPV UL51蛋白主要分布在法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟、食道、和腸道中，并且主要定位于淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞、巨噬細(xì)

11、胞和上皮細(xì)胞的胞漿中。本研究不僅有助于理解在急性DPV感染時(shí)，DPV的致病機(jī)理，同時(shí)也為α-皰疹病毒UL51蛋白同源物的定位和分布的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 7基于重組UL51蛋白的間接ELISA法和膠體金免疫層析試紙條法檢測(cè)鴨瘟病毒抗體的研究和應(yīng)用 DPV感染給世界上養(yǎng)鴨國(guó)家和地區(qū)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。DPV特異性抗體的監(jiān)測(cè)是評(píng)價(jià)DPV弱毒疫苗效果和制定合理的免疫程序的關(guān)鍵。因此，本研究中，基于純化的重組UL51蛋白，我們分別建

12、立了一種間接ELISA法(UL51-ELISA)和一種免疫層析試紙條法（UL51-ICS）來(lái)檢測(cè)DPV血清抗體。首先對(duì)UL51-ELISA法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，最適重組UL51蛋白包被量為2.5μg/100μL，最佳的血清稀釋倍數(shù)為1:200，最佳的酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)為1:2000；用建立的UL51-ELISA法對(duì)鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、鴨疫里默氏菌(RA)、鴨大腸桿菌(E.coli)的陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，特異性

13、好；對(duì)酶標(biāo)板內(nèi)或板間重復(fù)試驗(yàn)顯示變異系數(shù)均小于10％，能檢出經(jīng)1:3200倍稀釋的DPV陽(yáng)性血清。UL51-ICS是基于膜層析原理，并以膠體金標(biāo)記的重組UL51蛋白和膠體金標(biāo)記的羊抗兔IgG混合物共同作為示蹤劑的一種方法。該ICS法將純化的重組UL51蛋白抗原包被于檢測(cè)線(T)，兔IgG包被于質(zhì)控線(C)。經(jīng)優(yōu)化和篩選，確定了UL51-ICS法中的重組UL51蛋白、兔IgG、膠體金標(biāo)記的重組UL51蛋白和膠體金標(biāo)記的羊抗兔IgG的最佳工

14、作濃度分別為2mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和2mg/mL。用建立的UL51-ICS法分別對(duì)非DPV的鴨源病原體陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為陰性，特異性好；并能檢出經(jīng)1:128倍稀釋的DPV陽(yáng)性血清。同時(shí)，該法也具有良好的批內(nèi)及批間重復(fù)性和較好的穩(wěn)定性，制備好的試紙條至少可在4℃或25℃保存1年；為了評(píng)價(jià)UL51-ELISA和UL51-ICS法的效果，我們同時(shí)用UL51-ELISA、UL51-ICS、包被全病毒的ELISA法(DP

15、V-ELISA)和中和試驗(yàn)(NT)四種方法對(duì)110份地方鴨血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與DPV-ELISA和NT相比，本研究建立的UL51-ELISA法與UL51-ICS法都有較高的特異性、敏感性和很高的的符合率，并且成本低，適于在現(xiàn)場(chǎng)或?qū)嶒?yàn)室進(jìn)行DPV感染的血清學(xué)監(jiān)測(cè)。
　　 8基于抗重組UL51蛋白抗體的抗原捕獲ELISA法和膠體金免疫層析試紙條法檢測(cè)DPV的研究和應(yīng)用本研究中，我們使用純化的大鼠抗重組UL51蛋白多克隆抗體和兔

16、抗重組UL51蛋白多克隆抗體，分別建立了一種抗原捕獲ELISA法(AC-ELISA)和一種膠體金免疫層析試紙條(ICS)法來(lái)檢測(cè)DPV。使用建立的抗原捕獲AC-ELISA方法，可以檢測(cè)到1:640倍稀釋的陽(yáng)性DPV細(xì)胞培養(yǎng)液中的DPV;檢測(cè)含DHV的鴨胚尿囊液、含RA的菌體培養(yǎng)液和含E.coli菌體培養(yǎng)液等結(jié)果均為陰性。使用建立的ICS法，可以檢測(cè)到1:80倍稀釋的陽(yáng)性DPV細(xì)胞培養(yǎng)液中的DPV;檢測(cè)含DHV的鴨胚尿囊液、含RA的菌體培