鴨瘟病毒CHv株UL54基因及其編碼蛋白特性與基本功能研究.pdf

1、口’、_!，崩拳g翳&墅8璺疊⑧熬筻凝譬學(xué)蟹墮墊按2女鯉博士學(xué)位論文■■■毒CHv株UL54基因及箕■碼疊白特性與基本功能研究2017隼05月pU川農(nóng)業(yè)人學(xué)博I：學(xué)位論文摘要鴨瘟病毒(duckplaguevirusDPV)屬于皰疹病毒科、0【皰疹病毒亞科、馬立克氏病毒屬，其感染鴨、鵝等水禽，常造成嚴(yán)重的發(fā)病和死亡。與其它皰疹病毒相比，DPV分子生物學(xué)研究起步較晚，但發(fā)展迅速，目前多數(shù)基因的研究『F在進(jìn)行，而UL54基因及其編碼蛋白在DP

2、V致病過程中的具體作用尚屬未知。因此本論文的主要目的是希望通過分析DPVUL54基因及其編碼蛋白的特性與基本功能，幫助闡明DPV的致病機(jī)理。論文首先對DPVUL54基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析和多克隆抗體制各，并分別用實時熒光定量PCR和免疫印跡分析轉(zhuǎn)錄時kH幣u表達(dá)時相；其次用間接免疫熒光法對UL54蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位分析；然后采用種問異核體技術(shù)解析UL54蛋白的核質(zhì)穿梭活性及其功能區(qū)；接著構(gòu)建基于BAC的UL54基因缺失株和回復(fù)株并評價其

3、基本生物學(xué)特性(包括生長曲線、空斑形成和病毒基因組DNA拷貝數(shù))；隨后用實時熒光定量PCR分析UL54調(diào)控DPV其他基因的表達(dá)，并且分別基于核runoff試驗、直接熒光原位雜交試驗和核糖體一新生肽鏈復(fù)合物(RNC)，研究UL54在DPV基因轉(zhuǎn)錄、mRNA出核、翻譯過程中的作用；最后通過DAPI染核、HE染色、AnnexinVFITC／PI雙染流式檢測、Caspase3相對表達(dá)水平和活性檢測，研究DPVUL54對DEF細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果

4、表明：①DPVUL54基因包含的完整ORF大小為1377bp，編碼肽鏈由458個氨基酸組成，該肽鏈無信號肽和跨膜區(qū)，包含18個抗原表位；其密碼子使用模式與大腸桿菌接近，除了編碼Met、Glu和Trp的密碼子外，其他氨基酸的密碼子使用都存在偏嗜性，且第三位偏向使用～T；UL54蛋白被預(yù)測出主要定位于細(xì)胞核，且包含1個核輸出信號(NES)和多個核定位信號(NLS)；②DPVUL54屬于立即早期基因，編碼蛋白分子量約570KDa；在病毒感染0

5、5／2h后能檢測到，24h達(dá)到峰值；轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的動態(tài)變化基本一致；③DPVUL54蛋白在28h主要定位于細(xì)胞質(zhì)，1236h逐漸進(jìn)行細(xì)胞核，48h完全入核，60h后少量出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)；④DPVUL54蛋白具有核質(zhì)穿梭活性；包含功能性NES，其對萊普霉素B(LMB)敏感，且對UL54蛋白自身定位沒有顯著影響；包含多個功能性NLS，其聯(lián)合作用影響UL54蛋白自身定位；UL54蛋白入核對病毒復(fù)制、空斑形成、病毒基因組DNA復(fù)制和各時期病毒基因mR

6、NA表達(dá)都有重要作用；⑤DPVUL54不是病毒復(fù)制必需的，但能促進(jìn)病毒增殖、空斑形成和病毒基因組DNA復(fù)制；⑥D(zhuǎn)PVUL54正負(fù)雙向調(diào)控ULl9、UL30、UL48、gC、gD和gK基因mRNA表達(dá)：對ULl9mRNA的調(diào)控以抑制為主；始終促進(jìn)UL30和gC基因mRNA表達(dá)；對UL48和gD基因mRNA是早期抑制，中后期促進(jìn)；對gK基因mRNA在感染早中期有促進(jìn)或抑制作用；⑦DPVUL54早期抑制UL30基因的轉(zhuǎn)錄，始終促進(jìn)其他時期的U