鴛鴦鴨MHCⅠ類分子蛋白表達(dá)與結(jié)構(gòu)分析及其限制性病毒T細(xì)胞表位的篩選.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體I(MHC I)廣泛存在于所有有核細(xì)胞表面,是由MHC I類基因編碼的重鏈(α鏈)同另一條染色體上p2m基因編碼的輕鏈(p2m鏈)以非共價(jià)鍵連接而組成,它可以和病毒的某些抗原多肽結(jié)合,將多肽遞呈到細(xì)胞表面,被CTL細(xì)胞的TCR識(shí)別,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答,這些多肽被稱為T(mén)細(xì)胞表位。為了闡明鴨MHC I的特征,進(jìn)一步體外重建鴨MHC I-β2m復(fù)合體來(lái)鑒定禽源病毒的T細(xì)胞表位,我們進(jìn)行了以下研究:
　　 1采

2、用RT-PCR技術(shù)從鴛鴦鴨脾臟組織提取的RNA中克隆了鴛鴦鴨MHC I類分子的a和β2m鏈基因。結(jié)果顯示,克隆獲得的909bpα鏈基因中包含1個(gè)完整的α鏈胞外區(qū)(功能區(qū))成熟肽基因序列以及部分跨膜區(qū)基因序列和信號(hào)肽序列,共編碼303個(gè)氨基酸。a鏈胞外區(qū)成熟肽長(zhǎng)度為271個(gè)氨基酸,其包含92個(gè)氨基酸的α1區(qū),89個(gè)氨基酸的α2區(qū),90個(gè)氨基酸的α3區(qū),在α2、α3區(qū)域分別存在2個(gè)半胱氨酸殘基,有1個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)不同物種α

3、2、a3區(qū)域差異較大,進(jìn)化關(guān)系顯示鴨比魚(yú)類、蛙、雞等低等脊椎動(dòng)物更接近人類MHC I類分子,推測(cè)其在動(dòng)物MHC I類分子的起源與分化中占有重要的位置。所克隆的440bp鴛鴦鴨β2m鏈基因中,前297bp為β2m鏈成熟肽基因,共編碼99個(gè)氨基酸,成熟肽第25位和80位為半胱氨酸(C),且在第80位半胱氨酸附近序列為“YTCRVDH”,這與免疫球蛋白超基因家族的特征基序“YxCxVxH”相符。與GenBank中已登陸的北京鴨β2m鏈基因序列

4、(AB246408)同源性為100％,證明了其高度保守性。
　　 2用pET-28a(+)/E.coli表達(dá)系高效表達(dá)了鴛鴦鴨MHC I類分子的α鏈胞外區(qū)和β2m鏈成熟肽,經(jīng)SDS-PAGE顯示目的蛋白大小分別為31.0 KDa和11.4 KDa,BandScan軟件分析顯示,目的蛋白的含量分別約占細(xì)菌總蛋白29.8％和36.5％。對(duì)克隆的鴛鴦鴨MHC I類分子的α鏈胞外區(qū)和β2m成熟肽基因核苷酸序列推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了二級(jí)結(jié)

5、構(gòu)(2D)、三級(jí)結(jié)構(gòu)(3D)分析,結(jié)果顯示鴛鴦鴨MHC I類分子的α鏈胞外區(qū)鏈成熟肽具有典型的α螺旋結(jié)構(gòu),其中β-折疊含量最少,為13％；α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量都在24％；其它松散結(jié)構(gòu)含量最為豐富,分布為40％。β2m鏈成熟肽蛋白中四種元件組成相對(duì)均衡,其中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和其它松散結(jié)構(gòu)含量較多,為26％,β-折疊含量則較少,為21％。同源建模的α鏈胞外區(qū)成熟肽的抗原多肽結(jié)合區(qū)(PBD)由2個(gè)反向平行的α螺旋和8條β片層組成,這同人(

6、HLA—A2)和小鼠(H2)結(jié)構(gòu)類似,β2m鏈成熟肽3D結(jié)構(gòu)與人及小鼠的類似,但在α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和其他松散結(jié)構(gòu)的具體位置與數(shù)目方面存在微小差異。
　　 3根據(jù)鴛鴦鴨MHC I類分子α鏈胞外區(qū)β2m鏈成熟肽的結(jié)構(gòu)和功能篩選出了3條可能為體外重建的鴛鴦鴨MHC I-β2m復(fù)合體所結(jié)合的禽流感病毒(Influenza A virus(A/duckhtenan/1652/2006(H5N1))核衣殼蛋白T細(xì)胞表位NP71-79(F

7、DERRNRYL)、NP217-215(IAYERMCNI)和NP380-388(LERSRYWAI)。
　　 綜上所述,本研究揭示了鴛鴦鴨MHC I類和β2m基因的特征,獲得了具有正常功能結(jié)構(gòu)的鴛鴦鴨MHC I類分子的α鏈胞外區(qū)和β2m鏈成熟肽,闡明了其2D結(jié)構(gòu)組成及3D結(jié)構(gòu)、功能,并在此基礎(chǔ)上篩選了鴛鴦鴨MHC I-β2m復(fù)合體可能結(jié)合的禽流感病毒T細(xì)胞表位,為進(jìn)一步構(gòu)建鴨MHC I-β2m復(fù)合體體外鑒定禽流感病毒及其它病毒