鴛鴦鴨恒定鏈基因的克隆、分子特征及其組織表達(dá)特性.pdf

1、恒定鏈(Invariant chain，Ii)分子作為MHCⅡ分子的伴侶分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中促進(jìn)了MHCⅡ分子正確折疊、九聚體化及靶向內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，在酸性內(nèi)體中外源性表位與CLIP序列交換并結(jié)合到MHCⅡ分子溝槽，進(jìn)而抗原被呈遞到細(xì)胞表面。Ii對(duì)MHCⅡ分子的靶向機(jī)理已被應(yīng)用到基于Ii的基因疫苗設(shè)計(jì)，取得了較好免疫效果，為基因疫苗設(shè)計(jì)開拓了新思路。除此，Ii還作為多種活性分子的受體參與多種生理過程，因此也成為多種疾病治療的新靶點(diǎn)。但有關(guān)Ii的研

2、究主要集中在人類和小鼠，對(duì)于禽類Ii結(jié)構(gòu)與功能研究尚處起步階段，而禽類生產(chǎn)卻面臨越來越多的病原挑戰(zhàn)，禽類疾病防治也需探索新方法。為此我們以鴛鴦鴨(Moscovy duck，Cairina moschata)為研究對(duì)象，對(duì)其恒定鏈及其異構(gòu)體進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)分析和結(jié)構(gòu)建模，為深入研究禽類恒定鏈結(jié)構(gòu)功能、進(jìn)化趨勢(shì)與應(yīng)用等積累理論基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)恒定鏈在鴛鴦鴨不同組織中的定量表達(dá)和定位表達(dá)特征進(jìn)行研究，初步探討了Ii表達(dá)與不同組織器官結(jié)構(gòu)、

3、功能之間的關(guān)系。
　　 首先，利用RACE等技術(shù)成功獲得了1188bp的鴛鴦鴨恒定鏈(MDIi-1，Genebankno.HQ909102)和1377bp的恒定鏈異構(gòu)體(MDIi-2)cDNA序列，其中MDIi-2含有189bp插入序列Tg區(qū)，從而證明鴛鴦鴨存在兩種恒定鏈異構(gòu)體形式。生物信息學(xué)分析表明MDIi-1編碼222個(gè)氨基酸，MDIi-1在核苷酸水平、氨基酸水平及空間結(jié)構(gòu)等方面高度保守，與其他物種Ii比對(duì)有相同的功能區(qū)，在

4、進(jìn)化上與其他鳥類Ii高度同源。在不同物種Ii各保守功能區(qū)中，CLIP區(qū)雖然保持著不低于50％的保守性，但不同物種CLIP區(qū)也呈現(xiàn)明顯的可變性，這可能是系統(tǒng)進(jìn)化中環(huán)境壓力下的適應(yīng)性選擇的結(jié)果。MDIi-2編碼285個(gè)氨基酸，其Tg區(qū)高度保守，蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)與其他物種Tg區(qū)高度相似。但MDIi-2不是Ii的主要表達(dá)形式。
　　 第二，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，在十二種組織中分別對(duì)MDIi-1和MDIi-2進(jìn)行實(shí)時(shí)相對(duì)定量PCR

5、。結(jié)果表明MDIi-1和MDIi-2兩種異構(gòu)體在同一組織中相伴表達(dá)，但MDIi-1是主要表達(dá)形式，而且表達(dá)水平顯著高于MDIi-2。MDIi-1和MDIi-2在被檢的十二種器官或組織中分別呈現(xiàn)明顯差異表達(dá)。脾、胸腺、法氏囊等經(jīng)典免疫器官呈現(xiàn)MDIi-1的高水平表達(dá)，可能與擔(dān)負(fù)機(jī)體主要免疫功能有關(guān)，但機(jī)體成年后胸腺和法氏囊MDIi-1表達(dá)水平可能隨年齡增長(zhǎng)而降低。小腸、肝臟、腎臟等器官也呈現(xiàn)MDIi-1的較高水平表達(dá)，其中在小腸粘膜表達(dá)水

6、平僅次于脾臟表達(dá)，MDIi-1在這些非傳統(tǒng)免疫器官可能擔(dān)負(fù)重要局部免疫功能。恒定鏈在不同組織均有表達(dá)暗示其對(duì)各種組織都是需要的，只是表達(dá)量高低與不同組織先天性結(jié)構(gòu)及所承擔(dān)的主要功能相關(guān)。恒定鏈不同異構(gòu)體形式在不同組織細(xì)胞中呈現(xiàn)基本一致的差異表達(dá)還暗示不同組織細(xì)胞存在保守的異構(gòu)體差異表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 第三，原核表達(dá)MDIi-1，以表達(dá)蛋白免疫小鼠制備抗MDIi-1的抗血清。應(yīng)用冷凍組織切片技術(shù)制備鴛鴦鴨消化管各段、肝臟、脾、胸

7、腺、法氏囊、肺、腎、骨骼肌、心肌等組織切片，以抗MDIi-1血清為一抗、Dylight488標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗對(duì)MDIi-1在多個(gè)器官組織中的分布規(guī)律進(jìn)行了熒光免疫組化定位檢測(cè)。顯示消化管各段粘膜層存在MDli的高表達(dá)巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞等，MDIi在粘膜上皮和固有層腺體上皮細(xì)胞呈弱表達(dá)且極性分布；肝細(xì)胞不表達(dá)MDIi，肝板之間存在個(gè)體較大的疑似Kupffer細(xì)胞、樹突細(xì)胞等強(qiáng)表達(dá)細(xì)胞；胸腺組織中T細(xì)胞不表達(dá)MDIi，由皮質(zhì)部向髓質(zhì)

8、部逐漸增多的網(wǎng)狀上皮細(xì)胞和交錯(cuò)突細(xì)胞等呈現(xiàn)MDIi的強(qiáng)表達(dá)；脾組織充滿大量強(qiáng)表達(dá)MDIi的B細(xì)胞；MDIi主要在法氏囊粘膜層表達(dá)，其中上皮細(xì)胞弱表達(dá)且極性分布，固有層淋巴濾泡含有大量高表達(dá)MDIi的B細(xì)胞，B細(xì)胞分布由皮質(zhì)向髓質(zhì)逐漸增多、表達(dá)增強(qiáng)；肺組織各級(jí)支氣管上皮細(xì)胞不表達(dá)MDIi，上皮下結(jié)締組織存少量散在強(qiáng)表達(dá)MDIi的疑似巨噬細(xì)胞；腎實(shí)質(zhì)的間質(zhì)中散布MDIi表達(dá)細(xì)胞，血管球和腎小管上皮不表達(dá)MDIi；骨骼肌和心肌組織只在肌纖維間