五龍鵝MHCⅠ基因克隆、組織表達(dá)及分子特性的研究.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibilitycomplex,MHC)是由緊密連鎖的高度多態(tài)的基因位點(diǎn)所組成的位于染色體上一個(gè)遺傳區(qū)域，廣泛存在于所有脊椎動(dòng)物，具有高度的多態(tài)性和保守性。該基因區(qū)編碼的蛋白通常稱為MHC分子或MHC抗原，是移植排斥的主要決定簇。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能可將MHC分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類。在結(jié)構(gòu)上Ⅰ類分子可分成肽結(jié)合區(qū)、Ig樣區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)4個(gè)部位。國(guó)內(nèi)外關(guān)于鵝免疫方面的研究較少，本試驗(yàn)以我國(guó)優(yōu)良

2、的地方品種——五龍鵝為試驗(yàn)對(duì)象，主要研究五龍鵝MHCclassⅠ基因分子特性，獲得如下研究結(jié)果： 1根據(jù)GenBank中雞(XM424372)，鼠(AY064389)，斑馬魚(yú)(BC066745)等的MHCclassⅠ基因保守序列，使用PrimerPremier5.0與Oligo6.0程序設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)從有絲分裂原刀豆蛋白A(ConA)刺激18h活化的五龍鵝脾細(xì)胞中擴(kuò)增出相應(yīng)大小的基因，

3、經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定，將目的片段與pAT2載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，提取質(zhì)粒，對(duì)序列進(jìn)行測(cè)定，擴(kuò)增出1062bp的基因，將測(cè)得的序列遞交到GenBank中，獲得登陸號(hào)為：AM114925。 2根據(jù)測(cè)得的基因cDNA序列，重新設(shè)計(jì)引物，提取基因組DNA，利用LA-PCR方法從五龍鵝基因組DNA中克隆了MHCclassⅠ類分子的基因組序列并分析其基因組結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)酶切鑒定和PCR鑒定，獲得五龍鵝的基因組MHCclassⅠ序

4、列，共有2594bp個(gè)堿基，將測(cè)得的序列遞交到GenBank中，獲得登陸號(hào)為：AM114924。利用ContigExpress生物軟件和VecScreen程序比較五龍鵝MHCclassⅠ的DNA序列和cDNA序列，發(fā)現(xiàn)鵝MHCclassⅠ含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子。 3用TaqMan技術(shù)建立了一種實(shí)時(shí)Realtime-PCR的方法，用于檢測(cè)鵝MHCclassⅠ基因，無(wú)菌采取鵝心肝、脾，肺、腎、胸腺、法氏囊、腦、肌肉和胚胎組織，

5、進(jìn)行實(shí)時(shí)Realtime-PCR，該方法具有較好的敏感性和特異性，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MHCclassⅠ基因在鵝的組織中按不同的表達(dá)量關(guān)系為：法氏囊＞脾臟＞胸腺＞腦＞肺＞肌肉＞腎＞心?。九咛ィ靖危ㄟ^(guò)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)免疫器官中MHCclassⅠ基因的表達(dá)量要比其它器官的高。 4運(yùn)用生物信息學(xué)的方法進(jìn)一步分析了五龍鵝MHCclassⅠ基因核酸序列及氨基酸序列(編號(hào)WLMHCclassⅠ)。核酸DNA序列基因酶切圖譜分析獲得21種常見(jiàn)限制性內(nèi)

6、切酶的酶切位點(diǎn)；WLMHCclassⅠ蛋白分子量為39074.69m.w，等電點(diǎn)pI為5.53；蛋白的疏水性為3.433，在第300-320氨基酸的C端有一段較強(qiáng)的疏水區(qū)；有兩個(gè)蛋白質(zhì)超家族，有44.4％的可能存在于線粒體內(nèi)。三維結(jié)構(gòu)中由兩個(gè)長(zhǎng)的α-螺旋，三個(gè)β-折疊構(gòu)成，α-螺旋之間形成一個(gè)空間凹陷。與其他16個(gè)物種的氨基酸序列多序列比對(duì)的進(jìn)化樹(shù)，表明鵝MHCclassⅠ與雞有64.1％的同源性，與鼠有43.5～44.4％的同源性，與