馴鹿β-防御素-1(reBD-1)基因的原核表達(dá)及蛋白活性的鑒定.pdf

1、防御素（defensin）是生物體先天性免疫系統(tǒng)中的一類短肽，是內(nèi)源性抗菌肽中的一個(gè)大家族。防御素具有廣譜的抗菌活性，無論在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外都可以直接殺死細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時(shí)對某些惡性腫瘤細(xì)胞也有毒殺作用。β-防御素是防御素家族的重要成員之一，本文對馴鹿β-防御素的表達(dá)、分離純化及抗菌活性等方面展開了初步研究。
　　本試驗(yàn)旨在構(gòu)建馴鹿β防御素-1（reindeerβ-defensin-1，reBD

2、-1）基因的原核表達(dá)載體 pET-32a（+）/reBD-1，誘導(dǎo) reBD-1融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并對其表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性進(jìn)行評價(jià)。利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出編碼reBD-1前原肽基因。從重組克隆載體pMD-19T/reBD-1中擴(kuò)增 reBD-1成熟肽編碼序列，并克隆入 pET-32a（+）中，在大腸桿菌 BL21(DE3)中用IPTG誘導(dǎo)表達(dá) reBD-1融合蛋白。表達(dá)的融合蛋白擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)一步純化后進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果

3、表明，編碼reBD-1前原肽和成熟肽的基因序列大小分別為225bp和138bp，目的基因的序列與reBD-1 mRNA序列同源性為100﹪。前原肽和成熟肽融合蛋白分子量分別為28KDa和24KDa。利用瓊脂糖擴(kuò)散法表明0.08 mg/ml的純化成熟肽蛋白對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的活性有明顯抵抗作用。結(jié)果顯示，reBD-1前原肽及成熟肽的融合蛋白在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。成熟肽融合蛋白對革蘭氏陽性菌、陰性菌的活性有抗性，前原肽融合蛋白